Kompleti i PCR direkt i bimëve
Numri i maceve: HCR2020A
Kompleti Plant Direct PCR është i përshtatshëm për amplifikimin e drejtpërdrejtë të gjetheve të bimëve, farave, etj., dhe mund të përdoret për ekzaminimin e mostrave të bimëve që nuk përmbajnë polisaharide dhe polifenole.Amplifikimi i drejtpërdrejtë i polimerazës së ADN-së bazuar në evolucionin e drejtuar ka tolerancë superiore ndaj frenuesve PCR në bimë.Ndërkohë, ruan performancën e lartë të amplifikimit, e cila është e përshtatshme për amplifikimin e fragmenteve të ADN-së brenda 5 kb.Buferi unik i Lysis A në komplet mund të përdoret për të lizuar indet bimore të freskëta ose të ngrira.Është i lehtë për t'u përdorur dhe lizati mund të përdoret si shabllon për përforcim pa pastrim.Sistemi përmban agjentë mbrojtës që mundësojnë që mostrat e papërpunuara të përforcohen në mënyrë efektive pas ngrirjes dhe shkrirjes së përsëritur.2 × Plant Direct Master Mix duhet vetëm të shtojë primerë dhe shabllone për të kryer reaksionin e amplifikimit, duke reduktuar kështu operacionet e tubimit dhe duke përmirësuar xhiron e zbulimit dhe riprodhueshmërinë e rezultateve.
Komponentët
| Komponentët | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Përzierje Master Direct Direct | 1.25 ml | 4×1,25 ml |
| Tampon i lizës direkte të bimëve A | 5 ml | 20 ml |
| Tampon i lizës direkte të bimëve B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lisis Buffer B është një reagent opsional, i cili përdoret për të neutralizuar Bufferin A të Lizës Direkte të bimës për zgjatjen e kohës së ruajtjes së mostrave.Mund të përdoret sipas situatës aktuale.
Kushtet e ruajtjes
2 × Mbillni Direkt Master Mix, ruajeni në -30 ~ -15℃ dhe shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur;Mbillni tamponin e drejtpërdrejtë të lizës, ruajeni në -30 ~ -15 ℃ ose 2 ~ 8 ℃.
Procesi i eksperimentit
Përpunimi i mostrës-Gjethja e bimës
Metoda e drejtpërdrejtë:Rekomandohet përdorimi i gjetheve të reja.Përdorni një vrimë me një diametër fiks 0,5 – 3 mm për të marrë një mostër të vogël dhe uniforme, dhe më pas shtoni direkt kampionin në sistemin PCR (rekomandohet sistemi 50 μl).Shënim, sigurohuni që kampioni të jetë në solucionin PCR dhe jo në murin e tubit.Nëse përdoret PCR direkte për të amplifikuar fragmente të gjata dhe mostra komplekse, përdorimi i një kampioni me diametër më të vogël (0,5 – 1 mm) si shabllon mund të ndihmojë për të marrë rezultate më të mira.
Metoda e lizës së bluarjes:Rekomandohet përdorimi i gjetheve të reja.Merrni një copë të vogël gjetheje (rreth 1 – 3 mm në diametër), vendoseni në 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab dhe bluajeni sa më shumë që të jetë e mundur (ky hap mund të bëhet duke shtrydhur gjethen me një majë pipete 100 μl për të grirë mostrën) .Nëse përdoren vëllime më të mëdha të indit të gjetheve (të mos kalojnë 7 mm), rriteni volumin e tamponit të hollimit në 50 μl.Pasi gjethet janë bluar, zgjidhja duhet të duket e gjelbër.Pas një centrifugimi të shkurtër, shtoni 1 μl të supernatantit në sistemin PCR si shabllon reagimi.
Metoda e lizës termike:Rekomandohet përdorimi i gjetheve të reja.Merrni një copë të vogël gjetheje (rreth 1 – 3 mm në diametër), vendoseni në 20 μl Plant Direct Lisis Buffer A dhe ngroheni në 95°C për 5 – 10 min.Koha e lizës mund të zgjatet në mënyrë të përshtatshme për gjethet që janë të vështira për t'u liruar (jo më shumë se 20 minuta).Nëse përdoren vëllime më të mëdha të indit të gjetheve (të mos kalojnë 7 mm), rriteni volumin e tamponit të hollimit në 50 μl.Pas ngrohjes, centrifugoni shkurtimisht dhe shtoni 1 μl supernatant në sistemin PCR si shabllon reagimi.
Përpunimi i mostrës- Farë bimore
Metoda e lizës së bluarjes:Përdorni një bisturi për të prerë farat me një diametër 5 mm, shtoni ato në 100 μl Plant Direct Lisis Buffer A dhe bluajeni kampionin me një majë pipete ose mjete të tjera.Përzieni për një kohë të shkurtër dhe lëreni të qëndrojë në temperaturën e dhomës për 3 – 5 minuta.Sigurohuni që kampioni i farës të jetë zhytur në tampon hollimi.Pas një centrifugimi të shkurtër, shtoni 1 μl të supernatantit në sistemin PCR si shabllon reagimi.
Metoda e lizës termike:Përdorni një bisturi për të prerë farat me një diametër 5 mm, shtoni ato në 100 μl Plant Direct Lisis Buffer A dhe ngrohni në 95°C për 5 – 10 min.Koha e lizës mund të zgjatet në mënyrë të përshtatshme për gjethet që janë të vështira për t'u liruar (jo më shumë se 30 minuta).Pas ngrohjes, centrifugoni shkurtimisht dhe shtoni 1 μl supernatant në sistemin PCR si shabllon reagimi.
a.Gërshërët ose mjete të tjera mund të përdoren gjithashtu për prerjen e mostrave me madhësi të përshtatshme;nëse grushti ose gërshërët ripërdoren, ato duhet të pastrohen me 2% solucion hipoklorit natriumi përpara çdo përdorimi për të parandaluar ndotjen e kryqëzuar midis mostrave.
b.Sigurohuni që tamponi i Lizës së drejtpërdrejtë të bimëve të jetë shkrirë plotësisht përpara përdorimit.Nëse buferi është viskoz ose ka precipitate, mund të nxehet në 37℃ për ta shkrirë plotësisht përpara përdorimit.
c.Vëllimi i shabllonit në sistemin e reaksionit mund të rregullohet në mënyrë të përshtatshme sipas ndryshimit në vëllimin e materialit bimor dhe tretësit të shtuar.
Plant Direct Lisis Buffer
Buferi A i Lizës së drejtpërdrejtë të bimëve që gjendet në këtë produkt është optimizuar rreptësisht për të çliruar gjenomin e shumicës së indeve bimore dhe është i përshtatshëm për ruajtjen afatshkurtër të bimëve të papërpunuara në 4℃.Nëse kampioni duhet të ruhet për një periudhë më të gjatë kohore (p.sh., 1 – 2 muaj), rekomandohet transferimi i supernatantit në një tub të ri EP dhe ruajtja e tij në -20℃.Për t'i ruajtur mostrat në mënyrë më të qëndrueshme, shtoni një vëllim të barabartë të Plant Direct Lisis Buffer B në supernatantin e transferuar, përzieni mirë dhe ruajeni në -20℃.Koha e qëndrueshme e ruajtjes ndryshon me mostrat dhe gjendjet e bimëve.
Sistemi i reagimit
| ddH2O | Deri në 20.0 μl | Deri në 50.0 µl |
| 2 × Përzierje Master Direct Directa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 μM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 μM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Mostra e gjetheve të bimës / ekstraktit të papërpunuar(Referojuni përpunimit të mostrës) | Disk me gjethe 0,5 – 3 mm/x µl | Disk me gjethe 0,5 – 3 mm/x µl |
a.Ai përmban Mg2+në një përqendrim përfundimtar prej 2 mM.
b.Rekomandohet përdorimi i një përqendrimi përfundimtar prej 0.4μM për çdo primer.Përdorimi i tepërt i primerëve do të çojë në rritjen e amplifikimit jospecifik.
c.Sasia e mostrës së përdorur mund të rregullohet sipas situatës aktuale.Sasia e përdorur në një reaksion të vetëm të mostrës së papërpunuar të lizuar mund të rregullohet midis 2% - 20% të vëllimit të përgjithshëm të reaksionit.Përdorimi i shumë mostrave mund të shkaktojë dështim të amplifikimit.
Programi i reagimit
| Hapat | Temperatura | Koha |
| Denatyrimi fillestar | 98 ℃ | 5 min |
| Denatyrimi | 95 ℃ | 10 sek |
| Pjekja | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Zgjerim | 72 ℃ | 30 sek |
| Zgjatja përfundimtare | 72 ℃ | 5 min |
a.Denatyrimi fillestar (98℃, 5 min) promovon lizën e indeve bimore, duke çliruar ADN gjenomike që mund të përdoret për amplifikimin e PCR.Mos e shkurtoni kohën dhe mos e ulni temperaturën.
b.Rekomandohet ta vendosni atë të barabartë me vlerën Tm të primerit ose 2 ~ 4℃ më të lartë se vlera Tm.Polimeraza e ADN-së me amplifikim të drejtpërdrejtë e përdorur në këtë produkt është e ndryshme nga polimeraza konvencionale e ADN-së Taq dhe ka kërkesa të veçanta për temperaturën e pjekjes së reaksionit; përdorimi i temperaturës së lartë të pjekjes mund të zvogëlojë në mënyrë efektive amplifikimin jospecifik dhe të përmirësojë efikasitetin e amplifikimit.Për shabllonet komplekse, amplifikimi efikas mund të arrihet duke rregulluar temperaturën e pjekjes dhe duke zgjatur kohën e zgjatjes.
c.Nëse gjatësia e produktit të amplifikimit është ≤1 kb, koha e zgjatjes vendoset në 30 sek/kb;nëse gjatësia e produktit të amplifikimit është >1 kb, koha e zgjatjes vendoset në 60 sek/kb.
d.Për mostrat komplekse ose mostrat me rendiment të ulët të amplifikimit, numri i cikleve mund të rritet në mënyrë të përshtatshme në 40 -50 cikle.
Aplikacionet
Është i aplikueshëm për përforcim të drejtpërdrejtë të indeve bimore dhe për shqyrtimin e mostrave të bimëve që nuk përmbajnë polisaharide dhe polifenole.
Shënime
Vetëm për përdorim kërkimor.Jo për përdorim në procedurat diagnostike.
1. Për amplifikimin bruto të bimëve ose amplifikimin e drejtpërdrejtë, rekomandohet përdorimi i ADN-së gjenomike të pastruar si një kontroll pozitiv përpara fillimit të eksperimentit për të siguruar që sistemi, primerët dhe operacionet janë të sakta.
2. Polimeraza e ADN-së me përforcim të drejtpërdrejtë e përdorur në këtë komplet ka një aktivitet të fortë korrigjues.Nëse duhet të kryhet klonimi i TA, rekomandohet të pastrohet ADN-ja përpara se të shtohet adenina.
3. Udhëzime për Dizajnin e Primer:
a.Rekomandohet që baza e fundit në fundin 3′ të primerit të jetë G ose C.
b.Mospërputhjet e njëpasnjëshme duhet të shmangen në 8 bazat e fundit në fundin 3′ të primerit.c.Shmangni strukturat e kapëseve të flokëve në fundin 3′ të primerit.
d.Dallimet në vlerën Tm të primerit përpara dhe atij të kundërt duhet të jenë jo më shumë se 1℃ dhe vlera Tm duhet të rregullohet në 60 ~ 72℃ (Rekomandohet Primer Premier 5 për të llogaritur vlerën Tm).
e.Sekuencat shtesë të primerit që nuk përputhen me shabllonin, nuk duhet të përfshihen gjatë llogaritjes së vlerës Tm të primerit.
f.Rekomandohet që përmbajtja GC e primerit të jetë 40% -60%.
g.Shpërndarja e përgjithshme e A, G, C dhe T në abetare duhet të jetë sa më e barabartë.Shmangni përdorimin e rajoneve me përmbajtje të lartë GC ose AT.
h.Shmangni praninë e sekuencave plotësuese të 5 ose më shumë bazave qoftë brenda primerit ose midis dy abetareve dhe shmangni praninë e sekuencave plotësuese prej 3 ose më shumë bazash në fundin 3' të dy abetareve.
i.Përdorni funksionin NCBI BLAST për të kontrolluar specifikën e primerit për të parandaluar amplifikimin jospecifik.
