Kompleti i gjenotipizimit të miut
Numri i maces: HCR2021A
Ky produkt është një komplet i krijuar për identifikimin e shpejtë të gjenotipeve të miut, duke përfshirë nxjerrjen e papërpunuar të ADN-së dhe sistemin e amplifikimit PCR.Produkti mund të përdoret për amplifikimin PCR direkt nga bishti i miut, veshi, gishti i këmbës dhe inde të tjera pas ndarjes së thjeshtë nga Lysis Buffer dhe Proteinase k.Nuk ka tretje brenda natës, nxjerrje fenol-kloroform ose pastrim kolone, gjë që është e thjeshtë dhe shkurton kohën që kërkon eksperimentet.Produkti është i përshtatshëm për amplifikim të fragmenteve të synuara deri në 2 kb dhe reaksione multiplekse PCR me deri në 3 palë primerësh.Përzierja 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix përmban ADN polimerazë të modifikuar gjenetikisht, Mg2+, dNTP dhe një sistem buferi të optimizuar për të siguruar efikasitet të lartë të amplifikimit dhe tolerancë ndaj frenuesit, në mënyrë që reaksionet PCR të mund të kryhen duke shtuar shabllon dhe primerë dhe duke e rihidratuar produktin në 1×.Produkti PCR i përforcuar me këtë produkt ka një bazë të theksuar "A" në fundin 3' dhe mund të përdoret drejtpërdrejt për klonimin TA pas pastrimit.
Komponentët
| Komponenti | Madhësia |
| 2×Përzierje PCR e drejtpërdrejtë e indit të miut | 5×1.0 ml |
| Lisis Buffer | 2×20 ml |
| Proteinaza K | 800 μL |
Kushtet e ruajtjes
Produktet duhet të ruhen në -25~-15℃ për 2 vjet.Pas shkrirjes, Lysis Buffer mund të ruhet në 2~8℃ për përdorim të shumëfishtë afatshkurtër dhe të përzihet mirë kur përdoret.
Aplikacion
Ky produkt është i përshtatshëm për analizën e nokautit të miut, zbulimin transgjenik, gjenotipizimin dhe kështu me radhë.
Veçoritë
1.Operacion i thjeshtë: nuk ka nevojë për nxjerrjen e ADN-së gjenomike;
2.Aplikim i gjerë: i përshtatshëm për përforcim të drejtpërdrejtë të indeve të ndryshme të miut.
Udhëzimet
1.Lëshimi i ADN-së gjenomike
1) Përgatitja e lizatit
Lizati i indit përgatitet sipas numrit të mostrave të miut që do të lizohen (lizati i indit duhet të përgatitet në vend sipas dozës dhe të përzihet tërësisht për përdorim), dhe përqindja e reagentëve të kërkuar për një kampion të vetëm është si më poshtë:
| Komponentët | Vëllimi (μL) |
| Proteinaza K | 4 |
| Lisis Buffer | 200 |
2) Përgatitja dhe liza e mostrës
Përdorimi i rekomanduar i indeve
| Lloji iIndi | Vëllimi i rekomanduar |
| Bishti i miut | 1-3 mm |
| Veshi i miut | 2-5 mm |
| Gishti i miut | 1-2 copë |
Merrni një sasi të përshtatshme të mostrave të indeve të miut në tuba të pastër centrifuge, shtoni 200 μL lizatë të freskët të indeve në çdo tub centrifuge, rrotulloni dhe tundeni, më pas inkuboni në 55℃ për 30 minuta dhe më pas ngroheni në 98℃ për 3 minuta.
3) Centrifugimi
Tundeni mirë lizatin dhe centrifugoni në 12,000 rpm për 5 minuta.Supernatanti mund të përdoret si shabllon për amplifikimin PCR.Nëse shablloni është i nevojshëm për ruajtje, transferojeni supernatantin në një tub tjetër centrifuge steril dhe ruajeni në -20℃ për 2 javë.
2.Përforcimi PCR
Hiqni përzierjen 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix nga -20℃ dhe shkrini në akull, përzieni me kokë poshtë dhe përgatiteni sistemin e reagimit PCR sipas tabelës së mëposhtme (operoni në akull):
| Komponentët | 25μLSistemi | 50μLSistemi | Përqendrimi përfundimtar |
| 2×Përzierje PCR e drejtpërdrejtë e indit të miut | 12.5 μL | 25 μL | 1× |
| Primer 1 (10μM) | 1.0 μL | 2.0 μL | 0.4μM |
| Primer 2 (10μM) | 1.0 μL | 2.0 μL | 0.4μM |
| Produkti i ndarjesa | Siç kërkohet | Siç kërkohet |
|
| ddH2O | Deri në 25 μL | Deri në 50 μL |
|
Shënim:
a) Sasia e shtuar nuk duhet të kalojë 1/10 e sistemit dhe nëse shtohet shumë, amplifikimi i PCR mund të pengohet.
Kushtet e rekomanduara të PCR
| Hapi i ciklit | Temp. | Koha | Ciklet |
| Denatyrimi fillestar | 94 ℃ | 5 min | 1 |
| Denatyrimi | 94 ℃ | 30 sek | 35-40 |
| Pjekjaa | Tm + 3 ~ 5 ℃ | 30 sek | |
| Zgjerim | 72 ℃ | 30 sek/kb | |
| Zgjatja përfundimtare | 72 ℃ | 5 min | 1 |
| - | 4 ℃ | Mbaje | - |
Shënim:
a) Temperatura e pjekjes: Duke iu referuar vlerës Tm të abetares, rekomandohet të vendosni temperaturën e pjekjes në vlerën më të vogël Tm të primerit +3~5℃.
Probleme dhe zgjidhje të përbashkëta
1.Nuk ka shirita të synuar
1) Produkti i tepërt i lizës.Zgjidhni sasinë më të përshtatshme të shabllonit, zakonisht jo më shumë se 1/10 e sistemit;
2) Madhësia shumë e madhe e mostrës.Holloni lizatin 10 herë dhe më pas amplifikoni, ose zvogëloni madhësinë e kampionit dhe rilizoni;
3) Mostrat e indeve nuk janë të freskëta.Rekomandohet përdorimi i mostrave të indeve të freskëta;
4) Cilësi e dobët e primerit.Përdorni ADN-në gjenomike për amplifikimin për të verifikuar cilësinë e primerit dhe për të optimizuar modelin e primerit.
2.Përforcim jo specifik
1) Temperatura e pjekjes është shumë e ulët dhe numri i ciklit është shumë i lartë.Rritja e temperaturës së pjekjes dhe zvogëlimi i numrit të cikleve;
2) Përqendrimi i shabllonit është shumë i lartë.Zvogëloni sasinë e shabllonit ose holloni shabllonin 10 herë pas përforcimit;
3) Specifikimi i dobët i abetares.Optimizoni dizajnin e primerit.
Shënime
1.Për të shmangur kontaminimin e kryqëzuar ndërmjet kampionëve, duhet të përgatiten mjete të shumta për marrjen e mostrave dhe sipërfaqja e veglave mund të pastrohet me tretësirë hipoklorit 2% të natriumit ose pastrues të acidit nukleik pas çdo kampionimi nëse kërkohet përdorimi i përsëritur.
2.Rekomandohet përdorimi i indeve të freskëta të miut dhe vëllimi i marrjes së mostrave nuk duhet të jetë shumë i madh për të shmangur ndikimin e rezultateve të amplifikimit.
3.Lysis Buffer duhet të shmangë ngrirje-shkrirjen e shpeshtë dhe mund të ruhet në 2~8℃ për përdorim të shumëfishtë afatshkurtër.Nëse ruhet në temperaturë të ulët, mund të ketë reshje dhe duhet të treten plotësisht përpara përdorimit.
4.PCR Mix duhet të shmangë ngrirje-shkrirjen e shpeshtë dhe mund të ruhet në 4℃ për përdorim të përsëritur afatshkurtër.
5.Ky produkt është vetëm për kërkime shkencore eksperimentale dhe nuk duhet të përdoret në diagnostikimin ose trajtimin klinik.
