2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Numri i maceve: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) është projektuar për të kryer PCR direkt nga mostrat pa nxjerrjen e ADN-së ose përgatitjen e mostrës.Ky reagent përbëhet nga polimeraza e ADN-së me fillim të nxehtë, glikozilaza uracile e ADN-së (UNG), frenuesi i RNazës, MgCl2, dNTP (me dUTP në vend të dTTP) dhe stabilizues, për PCR sasiore (qPCR).Ky reagent paraformon tolerancë të lartë ndaj frenuesit, dhe kështu mund të aplikohet drejtpërdrejt në zbulimin e mostrave si shtupë fyti, pështymë, gjak të plotë kundër koagulimit, plazmë dhe serum pa ekstraktim të ADN-së.Reagenti përdor tampon të pronarit për qPCR me enzima të përziera të polimerazës anti-inhibitore të ADN-së dhe enzimës UNG.Prandaj, mund të marrë një amplifikim të mirë të gjeneve të synuara në mostrat që përmbajnë frenues dhe të pengojë amplifikimin fals pozitiv të shkaktuar nga ndotja e mbetur nga PCR dhe aerosol.Ky reagent është i pajtueshëm me shumicën e instrumenteve sasiore fluoreshente PCR, si Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche etj.
Komponentët
1. Përzierje Enzime/UNG 50×SensiDirect
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Kushtet e ruajtjes
Të gjithë përbërësit duhet të mbahen në -20℃ për ruajtje afatgjatë dhe 4℃ deri në 3 muaj.Ju lutemi përzieni tërësisht pas shkrirjes dhe centrifugoni përpara përdorimit.Shmangni ngrirje-shkrirjen e shpeshtë.
Protokolli i Çiklizmit
| Hapi | Temperatura | Koha | Cikli |
| Tretja | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivizimi i polimerazës | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denatyrë | 95 ℃ | 10-20 | 40-50 |
| Pjekja/Zgjatja | 56-64 ℃ | 20-60 |
Udhëzime për vendosjen e tubave
| Reagent | Vëllimi për reagimi | Vëllimi për reagim | Përqendrimi përfundimtar |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 μL | 25 µL | 1× |
| 50×Përzierje Enzime/UNG SensiDirect | 0,5 µL | 1µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1µL | 2 μL | 1× |
| Mostra3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Vëllimi total | 25 μL | 50 μL | - |
1. Përqendrimi përfundimtar i abetares është zakonisht 0.2μM.Për rezultate më të mira, përqendrimi i primerit mund të optimizohet brenda intervalit 0.2-1μM.
2. Në përgjithësi, përqendrimi i sondës mund të optimizohet brenda intervalit 0,1-0,3μM.Përqendrimi optimal i sondës lidhet me instrumentin e amplifikimit PCR në kohë reale, llojin e sondës dhe llojin e substancës së etiketimit fluoreshente.Ju lutemi referojuni manualit të instrumentit ose kërkesave specifike të secilës sondë fluoreshente.
3. Llojet e ndryshme të mostrave përmbajnë lloje dhe përmbajtje të ndryshme të inhibitorit dhe numrit të kopjes së gjenit të synuar.Vëllimi i mostrës duhet të merret parasysh nga gjendja aktuale.Bëni një hollim të kampionit duke shtuar ujë pa nukleazë ose TE Buffer, nëse është e nevojshme.
4. Vëllimi i rekomanduar i mostrave të ndryshme:
| Mostra | Vëllimi për një 50 μL reagimi | Maksimumi raport |
| Gjak i plotë antikoagulues | 2.5 μL | 5% |
| Plazma | 15 μL | 30% |
| Serum | 10 μL | 20% |
| Tampon fyti | 10 μL | 20% |
| Pështymë | 10 μL | 20% |
Kontrolli i cilësisë
1. Zbulimi i funksionit: ndjeshmëria, specifika dhe përsëritshmëria e qPCR.
2. Nuk ka aktivitet ekzogjen nukleaza: nuk ka endonukleazë ekzogjene dhe ndotje ekzonukleaze.
Shënime të produktit
1. Ky produkt përdor një lloj të ri të polimerazës së ADN-së me fillim të nxehtë, e cila mund të aktivizohet në 1-5 minuta. Meqenëse buferi i reagimit të tij është optimizuar, ai është më i përshtatshëm për PCR sasiore me fluoreshencë të dyfishtë ose të shumëfishtë duke përdorur metodën e sondës.
2. Nëse vlera Rn e amplifikimit PCR është shumë e ulët ose amplifikimi është dukshëm i frenuar, zvogëlimi i sasisë së mostrës, rritja e vëllimit të reagimit ose hollimi i mëparshëm i kampionit mund të përmirësojë rezultatet.
3. Grumbullimi i gjakut, pështymës, urinës, shtupës së fytit, etj. duhet të ndjekë kërkesat e kritereve klinike dhe mostra e freskët mund të përdoret për të parandaluar degradimin e acidit nukleik.
4. Meqenëse amplikonët e ndryshëm kanë efikasitet të ndryshëm përdorimi nga dUTP dhe ndjeshmëri ndaj UNG, reagentët duhet të optimizohen nëse ndjeshmëria e zbulimit zvogëlohet kur përdoret sistemi UNG.Ju lutemi na kontaktoni për mbështetje teknike nëse është e nevojshme.
5. Për të shmangur amplifikimin e produkteve PCR të bartjes midis reaksioneve me një hap, kërkohet zona eksperimentale dhe pipeta e dedikuar për amplifikimin.Punoni me doreza dhe ndërroni shpesh dhe mos e hapni tubin e reagimit pas amplifikimit PCR.
