Hotstart Taq ADN Polimeraza
Hot Start Taq ADN Polimeraza (Modifikim i antitrupave) është një polimerazë e ADN-së e qëndrueshme termike me startim të nxehtë nga Thermus aquaticus YT-1, që ka një aktivitet polimerazë 5'→3' dhe një aktivitet endonukleazë flap 5'.Polimeraza e ADN-së Taq me fillim të nxehtë është një polimerazë e ADN-së Taq e cila modifikohet nga antitrupat termolabile Taq.Modifikimi i antitrupave rriti specifikën, ndjeshmërinë dhe rendimentin e PCR.
Komponentët
| Komponenti | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Buffer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq ADN Polimeraza (Antitrup i modifikuar) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Aplikacionet
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 në 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 dhe 50% glicerol.
Gjendja e ruajtjes
Transporti nën 0°C dhe ruhet në -25°C~-15°C.
Përkufizimi i njësisë
Një njësi përcaktohet si sasia e enzimës që përfshin 15 nmol dNTP në materialin e patretshëm në acid në 30 minuta në 75°C.
Kontrolli i cilësisë
1.EndAktiviteti onuclease:Inkubimi i 20 U enzimë me 4 μg ADN pUC19 për 4 orë në 37℃ rezultoi në asnjë degradim të dallueshëm të ADN-së siç përcaktohet nga elektroforeza me xhel.
2.5 kb Lambda PCR:25 Ciklet e amplifikimit PCR të 5 ng ADN-së Lambda me 1,25 njësi Taq ADN Polimerazë në prani të 200 μM dNTP dhe 0,2 μM primerësh rezulton në produktin e pritur 5 kb.
3.Aktiviteti i ekzonukleazës:Inkubimi i një reaksioni prej 50 µl që përmban një minimum prej 12,5 U të Taq ADN Polimerazës me 10 nmol oligonukleotid 5´-FAM për 30 minuta në 37℃ nuk jep degradim të dallueshëm.
4.Aktiviteti RNase:Inkubimi i reaksionit 10 μL që përmban 20 U enzimë me 1 μg transkripte ARN për 2 orë në 37°C rezultoi në asnjë degradim të dallueshëm të ARN-së siç përcaktohet nga elektroforeza me xhel.
5.Inaktivizimi i nxehtësisë:Nr.
Sistemi i reagimit
| Komponentët | Vëllimi |
| ADN-ja e shabllonita | opsionale |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| Primer i kundërt 10 μM | 0,5 μL |
| Përzierje dNTP (10 mM secila) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq Buffer | 5 μL |
| Taq ADN Polimerazab(5U/μL) | 0,125 μL |
| Ujë pa bërthama | Deri në 25 μL |
Shënime:
1) a.
| ADN | Shuma |
| Gjenomike | 1 ng-1 μg |
| Plazmide ose virale | 1 fq-1 ng |
2) b.Përqendrimi optimal i Taq DNA Polimerazës mund të variojë nga 5-50 njësi/mL (0,1-0,5 njësi/25 µL reaksion) në aplikime të specializuara.
Protokolli i ciklit termik
PCR
| Hapi | Temperatura(°C) | Koha | Ciklet |
| Denatyrimi fillestara | 95 ℃ | 1-3 min | - |
| Denatyrimi | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Cikle |
| Pjekjab | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Zgjerim | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Zgjatja përfundimtare | 68 ℃ | 5 min | - |
Shënime:
1) Një denatyrim fillestar prej 1 min në 95°C është i mjaftueshëm për shumicën e amplifikimit.Për shabllonet e vështira, rekomandohet një denatyrim më i gjatë prej 2-3 minutash në 95°C.Me PCR të kolonisë, rekomandohet një denatyrim fillestar prej 5 minutash në 95°C.
2) Hapi i pjekjes është zakonisht 15-60 s.Temperatura e pjekjes bazohet në Tm të çiftit të primerit dhe zakonisht është 45-68℃.
