Transkriptaza e kundërt RTL
Transkriptaza e kundërt RTL është një polimerazë e ADN-së e varur nga shablloni ARN, së cilës i mungon aktiviteti i ekzonukleazës 3'→5' dhe ka aktivitet RNase H.Kjo enzimë mund të përdorë ARN-në si shabllon për të sintetizuar një varg plotësues të ADN-së, e cila mund të aplikohet në sintezën e cDNA-së së vargut të parë, veçanërisht për RT-LAMP (amplifikimi izotermik i ndërmjetësuar nga unaza).Krahasuar me RTL transkriptazën e kundërt 1.0, ndjeshmëria është përmirësuar ndjeshëm, stabiliteti termik është më i fortë dhe reagimi në 65°C është më i qëndrueshëm.RTL transkriptaza e kundërt (pa glicerinë) mund të përdoret për të përgatitur preparate të liofilizuara, reagentë të liofilizuar RT-LAMP etj.
Përkufizimi i njësisë
Një njësi përfshin 1 nmol dTTP në materialin e precipitueshëm me acid në 20 minuta në 50°C duke përdorur poli(A)•oligo(dT)25 si shabllon-primer.
Komponentët
| Komponenti | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Transkriptaza e kundërt RTL (pa glicerol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1.5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1.5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Gjendja e ruajtjes
Transporti nën 0°C dhe ruhet në -25°C~-15°C.
Kontrolli i cilësisë
- Aktiviteti i mbetur iEndonukleaza:Një reaksion 50 μL që përmban 1 μg λDNA dhe 15 njësi RTL2.0 të inkubuar për 16 orë në 37 ℃ tregon të njëjtin model si kontrolli negativ me elektroforezë xhel.
- Aktiviteti i mbetur iEksonukleaza:Një reaksion 50 μL që përmban 1 μg λDNA të tretur Hind Ⅲ dhe 15 njësi RTL2.0 të inkubuara për 16 orë në 37 ℃ tregon të njëjtin model si kontrolli negativ me elektroforezë xhel.
- Aktiviteti i mbetur iNickase:Një reaksion 50 μL që përmban 1 μg pBR322 të mbimbështjellur dhe 15 njësi RTL2.0 të inkubuar për 4 orë në 37°C tregon të njëjtin model si kontrolli negativ me elektroforezë xhel.
- Aktiviteti i mbetur iRNase:Një reaksion 10 μL që përmban 0,48 μg MS2 ARN dhe 15 njësi RTL2.0 të inkubuar për 4 orë në 37°C tregon të njëjtin model si kontrolli negativ me elektroforezë me xhel.
- E. coli gADN:E matur meE.colikomplete specifike të zbulimit HCD, 15 njësi RTL2.0 përmbajnë më pak se 1E. coligjenomi.
Konfigurimi i reagimit
Protokolli i Sintezës së cADN-së
| Komponentët | Vëllimi |
| ARN shabllon a | opsionale |
| Oligo(dT) 18~25 (50mM) ose Përzierje e rastësishme Primer (60uM) | 2 μL |
| Përzierje dNTP (10 mM secila) | 1 μL |
| Frenues RNase (40 U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transkriptaza 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Ujë pa bërthama | Deri në 20 μL |
Shënime:
1) Doza e rekomanduar e ARN totale është 1ng~1μg
2) Doza e rekomanduar e mRNA ishte 50ng~100ng
Termo-biçikleta Kushtet për një rutinë reagimi:
| Temperatura (°C) | Koha |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Shënime:
1) Nëse përdoret Random Primer Mix, një hap inkubimi në 25°C.
2) Nëse përdoret përzierja e primerit të synuar, një hap inkubimi në 55°C për 10~30 minuta.
Protokolli RT-LAMP
| Komponentët | Vëllimi | Përqendrimi përfundimtar |
| ARN shabllon | opsionale | ≥10 kopje |
| Përzierje dNTP (10 mM) | 3.5 μL | 1,4 mm |
| Primerët FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Primerë F3/B3 (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Frenues i RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksioni |
| RTL Reverse Transkriptaza 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reaksion |
| Bst V2 ADN Polimeraza (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksioni |
| MgSO4 (100 mM) | 1.5 μL | 6 mM (Gjithsej 8 mm) |
| Bufer 10×HC RTL (ose bufer 10×HC Bst V2) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Ujë pa bërthama | Deri në 25 μL | - |
Shënime:
1) Përziejini me vorbull dhe centrifugoni shkurt për ta mbledhur.Inkubimi në temperaturë konstante në 65°C për 1 orë.
2) Dy buferët janë të ndërveprueshëm dhe kanë të njëjtën përbërje.
Shënime
1.Ky produkt do të formojë një ngurtë të bardhë kur ruhet në -20 °C.E heqim nga -20°C dhe e vendosim në akull për rreth 10 minuta.Pas shkrirjes mund të përdoret duke e tundur dhe përzier.
2. Produkti cDNA mund të ruhet në -20°C ose -80°C ose të përdoret menjëherë për reaksion PCR.
3. Për të parandaluar ndotjen me RNase, ju lutemi mbani të pastër zonën e eksperimentit dhe mbani doreza dhe maska të pastra gjatë funksionimit.
