Proteinaza K mNGS (e lëngshme)
Proteinaza K është një proteazë serine e qëndrueshme me specifikë të gjerë të substratit.Ai degradon shumë proteina në gjendjen amtare edhe në prani të detergjenteve.Dëshmitë nga studimet e strukturës kristalore dhe molekulare tregojnë se enzima i përket familjes së subtilisinës me një treshe katalitike të zonës aktive (Asp39- E tij69-Ser224).Vendi mbizotërues i ndarjes është lidhja peptide ngjitur me grupin karboksil të aminoacideve alifatike dhe aromatike me grupe amino alfa të bllokuara.Zakonisht përdoret për specifikën e tij të gjerë.Kjo proteinazë K është krijuar posaçërisht për mNGS.Krahasuar me proteinazën tjetër K, ajo përmban edhe më pak kontaminim me acid nukleik me të njëjtën performancë enzimatike, e cila mund të sigurojë më mirë aplikimin mNGS në rrjedhën e poshtme.
Kushtet e ruajtjes
2-8 ℃ për 2 vjet
Specifikim
| Pamja e jashtme | Lëng pa ngjyrë në kafe të çelur |
| Aktiviteti | ≥800 U/ml |
| Përqendrimi i proteinave | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nuk u zbulua asnjë |
| DNase | Nuk u zbulua asnjë |
| RNase | Nuk u zbulua asnjë |
Vetitë
| Numri EC | 3.4.21.64(Rekombinant nga albumi Tritirachium) |
| Pika izoelektrike | 7.81 |
| PH optimale | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Temperatura optimale | 65 ℃ Fig. 2 |
| stabiliteti i pH | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 orë) Fig. 3 |
| Stabiliteti termik | Nën 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Stabiliteti i ruajtjes | Mbi 90% aktivitet për 12 muaj në 25 ℃ |
| Aktivizuesit | SDS, ure |
| Frenuesit | Diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Aplikacionet
1. Kompleti i diagnostikimit gjenetik
2. Kompletet e nxjerrjes së ARN-së dhe ADN-së
3. Nxjerrja e komponentëve joproteinikë nga indet, degradimi i papastërtive proteinike, si ADN-javaksinat dhe përgatitja e heparinës
4. Përgatitja e ADN-së së kromozomeve me elektroforezë pulsuese
5. Western blot
6. Diagnoza in vitro e reagentëve të albuminës të glikoziluara enzimatike
Masa paraprake
Vishni doreza dhe syze mbrojtëse kur përdorni ose peshoni dhe mbajeni të ajrosur mirë pas përdorimit.Ky produkt mund të shkaktojë reaksion alergjik të lëkurës dhe acarim serioz të syve.Nëse thithet, mund të shkaktojë alergji ose simptoma të astmës ose dispne.Mund të shkaktojë acarim të frymëmarrjes.
Përkufizimi i njësisë
Një njësi (U) përcaktohet si sasia e enzimës që kërkohet për të hidrolizuar kazeinë për të prodhuar 1 μmoltirozinë në minutë në kushtet e mëposhtme.
Përgatitja e reagentëve
Reagjenti I: 1 g kazeinë qumështi u shpërnda në 50 ml solucion 0.1 M të fosfatit të natriumit (pH 8.0), u inkubua në 65-70 ℃ ujë për 15 minuta, u trazua dhe u tret, u fto me ujë, u rregullua me hidroksid natriumi në pH 8.0 dhe u fiksua në vëllim. 100 ml.
Reagenti II: 0.1M acid trikloroacetik, 0.2M acetat natriumi, 0.3M acid acetik.
Reagjenti III: 0.4M Na2CO3zgjidhje.
Reagenti IV: Reagenti forintë i holluar me ujë të pastër për 5 herë.
Reagenti V: Diluent enzimë: 0.1M tretësirë fosfat natriumi (pH 8.0).
Reagenti VI: tretësira e tirozinës: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozinë e tretur me 0,2M HCl.
Procedura
1. 0,5 ml reagent I ngrohet paraprakisht në 37℃, shtoni 0,5 ml tretësirë enzime, përzieni mirë dhe inkuboni në37℃ për 10 minuta.
2. Shtoni 1 ml reagent II për të ndaluar reaksionin, përzieni mirë dhe vazhdoni inkubimin për 30 minuta.
3. Tretësira e reaksionit të centrifuguar.
4. Merrni 0,5 ml supernatant, shtoni 2,5 ml reagent III, 0,5 ml reagent IV, përzieni mirë dhe inkuboni në 37℃për 30 minuta.
5. OD660u përcaktua si OD1;Grupi i kontrollit bosh: 0.5 ml reagent V përdoret për të zëvendësuar enzimënzgjidhje për të përcaktuar OD660si OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Lakorja standarde e L-tirozinës: 0,5 ml tretësirë L-tirozine me përqendrime të ndryshme, 2,5 ml Reagent III, 0,5 ml Reagent IV në tub centrifuge 5 ml, inkuboni në 37℃ për 30 minuta, zbuloni për OD660për përqendrim të ndryshëm të L-tirozinës, atëherë është marrë kurba standarde Y=kX+b, ku Y është përqendrimi i L-tirozinës, X është OD600.
Llogaritja
2: Vëllimi total i tretësirës së reaksionit (mL)
0.5: Vëllimi i tretësirës së enzimës (mL)
0.5: Vëllimi i lëngut të reaksionit i përdorur në përcaktimin kromogjenik (mL)
10: Koha e reagimit (min)
Df: Hollimi i shumëfishtë
C: Përqendrimi i enzimës (mg/mL)
Referencat
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofiza.Res.Komuna.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,euro.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Klonimi Molecular: Një Manual Laboratori, botimi i 2-të, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Shifrat
Fik.1 Optimumi pH
100mM tretësirë buferike:pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9.0-12.5, Glicine-NaOH. Përqendrimi i enzimës: 1 mg/mL
Fig.2 Temperatura optimale
Reaksioni në tampon K-fosfat 20 mM pH 8.0.Përqendrimi i enzimës: 1 mg/mL
Fig.3 pH Stabiliteti
25 ℃, 16 orë-trajtim me tretësirë tampon 50 mM: pH 4,5- 5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0- 12,5, Glicine-NaOH.Përqendrimi i enzimës: 1 mg/mL
Fig.4 Termike stabiliteti
Trajtim 30 min me bufer Tris-HCl 50 mM, pH 8.0.Përqendrimi i enzimës: 1 mg/mL
Fig.5 Magazinimi stability at 25 ℃
