Proteinaza K NGS (pluhur)
Numri i maceve: HC4507A
NGS Proteaza K është një proteazë serine e qëndrueshme me aktivitet të lartë enzimë dhe specifikë të gjerë të substratit. Enzima dekompozon në mënyrë preferenciale lidhjet esterike dhe lidhjet peptide ngjitur me terminalin C të aminoacideve hidrofobike, aminoacideve që përmbajnë squfur dhe aminoacideve aromatike.Pra, shpesh përdoret për të degraduar proteinat në peptide të shkurtra.NGS Proteaza K është një proteazë tipike serine me Asp39- E tij69-Ser224Triada katalitike e cila është unike për proteazat e serinës, dhe qendra katalitike është e rrethuar nga tërheqja e Ca2+vende lidhëse për stabilizim, duke mbajtur aktivitet të lartë enzimë në një gamë më të gjerë kushtesh.
Specifikim
| Pamja e jashtme | Pluhur amorf i bardhë në të bardhë, i liofilizuar |
| Veprimtari specifike | ≥40U/mg e ngurtë |
| DNase | Nuk u zbulua asnjë |
| RNase | Nuk u zbulua asnjë |
| Biobrëndë | ≤50CFU/g të ngurtë |
| Mbetjet e acidit nukleik | <5 pg/mg të ngurtë |
Vetitë
| Burimi | Albumi Tritirachium |
| Numri EC | 3.4.21.64(Rekombinant nga albumi Tritirachium) |
| Peshë molekulare | 29 kDa (SDS-FAQE) |
| Pika izoelektrike | 7.81 Fig.1 |
| PH optimale | 7.0-12.0 (Të gjithë kryejnë aktivitet të lartë) Fig.2 |
| Temperatura optimale | 65℃ Fig.3 |
| Stabiliteti i pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Stabiliteti termik | Nën 50℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Stabiliteti i ruajtjes | Ruhet në 25℃ për 12 muaj Fig.6 |
| Aktivizuesit | SDS, ure |
| Frenuesit | Diizopropil fluorofosfat;fluorid benzilsulfonil |
Kushtet e ruajtjes
Ruajeni pluhurin e liofilizuar në -25~-15 ℃ për një kohë të gjatë larg dritës;Pas shpërbërjes, pjesëtoni në vëllimin e duhur për ruajtje afatshkurtër në 2-8℃ larg dritës ose ruajtje afatgjatë në -25~-15 ℃ larg dritës.
Masa paraprake
Vishni doreza dhe syze mbrojtëse kur përdorni ose peshoni dhe mbajeni të ajrosur mirë pas përdorimit.Ky produkt mund të shkaktojë reaksion alergjik të lëkurës dhe acarim serioz të syve.Nëse thithet, mund të shkaktojë alergji ose simptoma të astmës ose dispne.Mund të shkaktojë acarim të frymëmarrjes.
Përkufizimi i njësisë
Një njësi e NGS Proteazës K përcaktohet si sasia e enzimës që kërkohet për të hidrolizuar kazeinën në 1 μmol L-tirozinë në kushte standarde të përcaktimit.
Përgatitja e reagentëve
| Reagent | Prodhuesi | Katalogu |
| Kazeina teknikenga qumështi i gjedhit | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Acidi trikloroacetik | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetat natriumi | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Acid acetik | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Karbonat natriumi | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozina | Sigma | 93829 |
Reagjenti I:
Substrati: 1% kazeinë nga tretësira e qumështit të gjedhit: shpërndahet 1 g kazeinë qumështi gjedhi në 50 ml tretësirë fosfati natriumi 0,1 M, pH 8,0, ngrohet në banjë me ujë në 65-70 °C për 15 minuta, përzihet dhe shpërndahet, ftohet me ujë, rregullohet me hidroksid natriumi në pH 8.0 dhe hollohet në 100 ml.
Reagenti II:
Tretësirë TCA: 0.1M acid trikloroacetik, 0.2M acetat natriumi dhe 0.3M acid acetik (peshoni 1.64g acid trikloroacetik + 1.64g acetat natriumi + 1.724mL acid acetik radhazi, shtoni 50mL ujë të dejonizuar, rregulloni me pH40 në HCl. 100 ml).
Reagjenti III:
0,4 m tretësirë karbonat natriumi (peshoni 4,24 g karbonat natriumi anhidrik dhe shpërndajeni në 100 ml ujë)
Reagjenti IV:
Reagenti folin fenol: hollohet 5 herë me ujë të dejonizuar.
Reagjenti V:
Diluent enzimë: tretësirë 0,1 M fosfat natriumi, pH 8,0.
Reagenti VI:
Tretësirë standarde L-tirozinë:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tirozinë e tretur me 0.2M HCl.
Procedura
1. Ndizni spektrofotometrin UV-Vis dhe zgjidhni matjen fotometrike.
2. Vendosni gjatësinë e valës si 660 nm.
3. Ndizni banjën me ujë, vendosni temperaturën në 37℃, sigurohuni që temperatura të jetë e pandryshuar për 3-5 minuta.
4. Ngrohni paraprakisht 0,5 ml substrate në një tub centrifuge 2 ml në banjë me ujë 37℃ për 10 minuta.
5. Ekstraktoni 0,5 ml tretësirë të holluar enzimë në tubin e centrifugës të parangrohur për 10 minuta.Cakto tretësin enzimë si grup bosh.
6. Shtoni 1,0 mL reagent TCA menjëherë pas reagimit.Përziejini mirë dhe inkuboni në një banjë uji për 30 minuta.
7. Tretësira e reaksionit të centrifuguar.
8. Shtoni komponentët e mëposhtëm në rendin e specifikuar.
| Reagent | Vëllimi |
| Supernatanti | 0,5 ml |
| 0.4M karbonat natriumi | 2,5 ml |
| Reagent folin fenol | 0,5 ml |
9. Përziejeni mirë përpara se ta inkuboni në një banjë uji në temperaturë 37℃ për 30 minuta.
10. OD660u përcaktua si OD1;Grupi i kontrollit bosh: Diluenti enzimë përdoret për të zëvendësuar tretësirën enzimë për të përcaktuar OD660si OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Lakorja standarde e L-tirozinës: 0,5 ml tretësirë L-tirozine me përqendrime të ndryshme, 2,5 ml 0,4 M karbonat natriumi, 0,5 ml reagent fenol folin në tubin centrifuge 5 ml, inkuboni në 37℃ për 30 minuta, zbuloni për OD660për përqëndrime të ndryshme të L-tirozinës, atëherë është marrë kurba standarde Y=kX+b, ku Y është përqendrimi i L-tirozinës, X është OD600.
Llogaritja
2: Vëllimi total i tretësirës së reaksionit (mL)
0.5: Vëllimi i tretësirës së enzimës (mL)
0.5: Vëllimi i lëngut të reaksionit i përdorur në përcaktimin kromogjenik (mL)
10: Koha e reagimit (min)
Df: Hollimi i shumëfishtë
C: Përqendrimi i enzimës (mg/mL)
Shifrat
Fig.1 Mbetjet e ADN-së
| Mostra | Ave C4 | Acidi nukleik Rimëkëmbja (pg/mg) | rikuperimi (%) | Nukleike totale Acidi ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| STD1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O pa ARN | I papërcaktuar | - | - | - |
Fig.2 PH optimale
Fig.3 Temperatura optimale
Fig.4 Stabiliteti i pH
Fig.5 Qëndrueshmëria termike
Fig.6 Stabiliteti i ruajtjes në 25℃
