Frenues i Rnase
Frenuesi i RNazës së Murinës është një frenues i RNazës së murit rekombinant i shprehur dhe i pastruar nga E.coli.Ai lidhet me RNazën A, B ose C në një raport 1:1 nëpërmjet lidhjes jokovalente, duke penguar kështu aktivitetin e tre enzimave dhe duke mbrojtur ARN-në nga degradimi.Megjithatë, nuk është efektiv kundër RNase 1, RNase T1, S1 nukleazës, RNase H ose RNase nga Aspergillus.Frenuesi i RNazës së murit u testua me RT-PCR, RT-qPCR dhe mRNA IVT dhe ishte i pajtueshëm me transkriptazat e kundërta të ndryshme komerciale, ADN polimerazat dhe ARN polimerazat.
Krahasuar me frenuesit njerëzorë të RNazës, frenuesi i RNazës së miut nuk përmban dy cisteina që janë shumë të ndjeshme ndaj oksidimit që shkakton inaktivizimin e frenuesit.Kjo e bën atë të qëndrueshëm në përqendrime të ulëta të DTT (më pak se 1 mM).Kjo veçori e bën atë të përshtatshëm për përdorim në reaksione ku përqendrimet e larta të DTT janë të pafavorshme ndaj reaksionit (p.sh. RT-PCR në kohë reale).
Aaplikimi
Ky produkt mund të përdoret gjerësisht në çdo eksperiment ku ndërhyrja e RNase është e mundur për të shmangur degradimin e ARN-së, si p.sh.
1.Sinteza e vargut të parë të cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, etj.
2.Mbron ARN-në nga degradimi gjatë transkriptimit/përkthimit in vitro (p.sh. sistemi i replikimit viral in vitro).
3.Frenimi i aktivitetit të RNase gjatë ndarjes dhe pastrimit të ARN-së.
Kushtet e ruajtjes
Produkti mund të ruhet në -25 ~ 15 ℃, i vlefshëm për 2 vjet.
Buferi i ruajtjes
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT dhe 50% glicerinë.
Përkufizimi i njësisë
Sasia e frenuesit të RNase të miut që kërkohet për të frenuar aktivitetin e 5 ng të ribonukleazës A me 50% u përcaktua si një njësi (U).
Pesha molekulare e proteinave
Pesha molekulare e frenuesit RNase të miut është 50 kDa.
Kontrolli i cilësisë
Eksonukleaza Aktiviteti:
40 U e frenuesit RNase të miut me 1 μg λ-Hind III ADN-ja e tretur në 37℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.
Aktiviteti i endonukleazës:
40 U e frenuesit RNase të miut me 1μg λ ADN në 37℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.
Nicking Aktiviteti:
40U i frenuesit RNase të miut me 1μg pBR322 në 37℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.
RNase Aktiviteti:
40U i frenuesit RNase të miut me 1.6μ g MS2 ARN për 4 orë në 37℃ nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.
E.coli ADN:
40 U të frenuesit të RNazës së miut ekzaminohen për praninë e ADN-së gjenomike të E. coli duke përdorur TaqMan qPCR me primerë specifikë për vendndodhjen e E. coli 16S rRNA.Kontaminimi i ADN-së gjenomike të E. coli është ≤ 0,1 pg/40 U.
Notes
1. Lëkundjet ose trazimet e dhunshme do të çojnë në inaktivizimin e enzimës.
2. Gama optimale e temperaturës së këtij frenuesi ishte 25-55 ℃, dhe u çaktivizua në 65℃ dhe më lart.
3. Aktivitetet e RNazës H, RNazës 1 dhe RNazës T1 nuk u frenuan nga frenuesi i RNazës së miut.
4. Frenimi i aktivitetit të RNase u gjet në një gamë të gjerë pH (pH 5-9 ishin të gjithë aktiv), dhe aktiviteti më i lartë u vu re në pH 7-8.
5. Meqenëse ribonukleazat zakonisht ruajnë aktivitetin në kushte denatyrimi, duhet pasur kujdes për të shmangur denatyrimin e molekulave të frenuesit RNase që janë kompleksuar me një ribonukleazë.Për të parandaluar çlirimin e ribonukleazës aktive, duhet të shmangen temperaturat më të larta se 50 °C dhe përqendrimet e larta të uresë ose agjentëve të tjerë denatyrues.
