Mini Kompleti i Ekstraktimit të ADN-së
Ky komplet miraton sistemin e optimizuar të tamponit dhe teknologjinë e pastrimit të kolonës me xhel silicë, e cila mund të rikuperojë fragmente ADN-je 70 bp – 20 kb nga përqendrime të ndryshme të xhelit të agarozës TAE ose TBE.Kolona e adsorbimit të ADN-së mund të përthithë posaçërisht ADN-në në kushte të larta të kripës.Përveç kësaj, kompleti mund të pastrojë drejtpërdrejt fragmentet e ADN-së nga produktet PCR, sistemet e reaksionit enzimatik ose produktet e papërpunuara të ADN-së të marra me metoda të tjera dhe të largojë papastërtitë si proteinat, komponimet e tjera organike, jonet inorganike të kripës dhe abetaret oligonukleotide.Mund të sigurojë që pastrimi të përfundojë brenda 10-15 minutash.ADN-ja e pastruar mund të përdoret drejtpërdrejt për lidhjen, transformimin, tretjen e enzimës, transkriptimin in vitro, PCR, sekuencën, mikroinjeksionin, etj.
Kushtet e ruajtjes
Ruajeni në -15 ~ -25 ℃ dhe transportojeni në temperaturën e dhomës.
Komponentët
| Komponentët | (100 rxns) |
| Bufer GDP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Bufer elucionit | 20 ml |
| FastPure ADN Mini Columns-G | 100 |
Bufer GDP:Tampon lidhës i ADN-së.
Buffer GW:Tampon larës;shtoni etanol absolut me volumin e treguar në shishe përpara përdorimit.
Bufer elucionit:Elucioni.
FastPure DNA Mini Columns-G:Kolonat e adsorbimit të ADN-së.
Tubat e koleksionit 2 ml:Tuba grumbullues për filtrim.
Materialet e Përgatitura
Tuba të sterilizuar 1,5 ml, etanol absolut dhe izopropanol (kur fragmenti i ADN-së është ≤100 bp, shtoni 1 vëllim
izopropanol në xhel 1 vëllim), banjë me ujë.
Procesi i eksperimentit
Shtoni 80 ml etanol për të holluar Buffer GW siç tregohet në etiketë përpara përdorimit, ruajeni në temperaturën e dhomës.
Mekanizmi
1. Zgjidhja e reaksionit PCR
Skema e nxjerrjes së xhelit: Skema e rikuperimit të zgjidhjes së reaksionit të PCR-së për shtimin e vëllimit të barabartë të buferit:Shtoni 5 herë vëllimin Buffer
2. GDP Llogaritni vëllimin e xhelit (100 μl është e barabartë me 100 mg)
Shpërndani xhelin
3. Ngrohni paraprakisht në 50-55℃
4. Bind Wash
Shtoni 300 μL të PBB-së tampon*
Shtoni 700 μL Buffer GW
Shtoni 700 μL Buffer GW
5. Elute
Shtoni 20 – 30 μL tampon elucioni ose ujë të dejonizuar
Shënime* Rikuperimi i lëngut të reagimit PCR pa këtë hap
Programi i nxjerrjes së xhelit
1. Pas elektroforezës së ADN-së për fraksionimin e fragmenteve të ADN-së, hiqni shiritin e vetëm të fragmentit të ADN-së nga xheli i agarozës nën dritën UV.Rekomandohet përdorimi i letrës absorbuese për të thithur lagështinë e dukshme të xhelit dhe për të minimizuar madhësinë e fetës së xhelit duke hequr sa më shumë që të jetë e mundur agarozën shtesë.Peshoni fetën e xhelit (pa tub mikrocentrifuge) për të llogaritur volumin e saj: Vëllimi i fetës xheli 100 mg është afërsisht 100 μL, duke supozuar se dendësia është 1 g/ml.
2. Shtoni vëllim të barabartë Buffer GDP, inkuboni në 50~55℃ për 7-10 minuta (sipas madhësisë së xhelit, rregulloni kohën e inkubacionit derisa xheli të tretet plotësisht).Përmbysni tubin 2 herë gjatë inkubacionit.
Δ Shtimi i 1-3 vëllimeve të PBB-së Buffer nuk do të ndikojë në efikasitetin e rikuperimit të ADN-së.Nëse fragmenti i ADN-së që do të rikuperohet <100 bp, duhet të shtohen 3 vëllime Buffer GDP;kur feta e xhelit të jetë tretur plotësisht, shtoni 1 vëllim izopropanol dhe përzieni plotësisht, pastaj vazhdoni në hapin tjetër.
3. Centrifugoni shkurtimisht për ta sjellë kampionin në fund të tubit, futni FastPure DNA Mini Columns-G në Tubat e Koleksionit 2 ml, transferoni me kujdes tretësirën maksimalisht 700 μL një herë në
koha për në kolonat e filtrimit, centrifugohet në 12,000 rpm (13,800 X g) për 30-60 sek.
4. Hidhni filtratin dhe shtoni 300 μL Buffer GDP në kolonë, inkuboni në temperaturën e dhomës për 1 min, centrifugoni në 12,000 rpm (13,800 X g) për 30-60 sek.
5. Hidhni filtratin dhe shtoni 700 μL Buffer GW (kontrolloni nëse është shtuar paraprakisht etanol absolut!) në kolonë, centrifugoni me 12,000 rpm (13,800 X g) për 30-60 sek.
Δ Ju lutemi shtoni Buffer GW rreth murit të kolonës së adsorbimit ose shtoni kapakun e pasmë Buffer GW dhe përzieni atë me kokë poshtë për 2 – 3 herë për të ndihmuar në shpëlarjen e plotë të kripës që ngjitet në murin e tubit.
6. Përsëriteni hapin 5.
Δ Shpëlarja me Buffer GW dy herë mund të sigurojë që kripa të hiqet plotësisht dhe të eliminojë ndikimin në eksperimentet e mëvonshme.
7. Hidhni filtratin dhe centrifugoni kolonën e zbrazët me 12,000 rpm (13,800 X g) për 2 min.
8. Futeni kolonën në një tub mikrocentrifuge të pastër 1,5 ml, shtoni 20 - 30 μL Buffer Elution në qendër të membranës së kolonës, inkuboni për 2 minuta dhe më pas centrifugoni në 12,000 rpm (13,800 X g) për 1 min.Hidheni kolonën, ruani ADN-në e fituar në -20 .
Δ Transferimi i supernatantit të hapit 8 në kolonë për t'u elutur përsëri dhe ngrohja paraprake e tamponit të elucionit në 55 (kur fragmenti i ADN-së >3 kb) mund të jetë i dobishëm për të rritur efikasitetin e rikuperimit.
Programi i rikuperimit të produkteve PCR
Ky protokoll është i zbatueshëm për të pastruar fragmentet e ADN-së nga produktet PCR, sistemi i reaksionit enzimatik dhe produkte të tjera të papërpunuara të ADN-së (përfshirë ADN-në gjenetike).Kjo zgjidhje mund të largojë në mënyrë efikase nukleotide të ndryshme, primerë, dimerë primer, molekulat e kripës, enzimat dhe papastërtitë e tjera.
1. Centrifugoni shkurtimisht produktet PCR, solucionin e reaksionit enzimatik dhe produkte të tjera të papërpunuara të ADN-së.Vlerësoni vëllimin e tyre me pipetë dhe transferojeni në një tub të sterilizuar 1,5 ml ose 2 ml.Shtoni ddH2O deri në vëllimin deri në 100 μL;ndërsa për ADN-në gjenomike me përqendrim të lartë, hollimi në 300 μL me ddH2O do të ndihmojë në përmirësimin e efikasitetit të rikuperimit.
2. Shtoni 5 vëllime Buffer GDP, përzieni tërësisht duke e përmbysur ose vorbulluar.Nëse fragmenti i ADN-së me interes >100 bp, duhet të shtohen 1,5 vëllime shtesë (mostra + GDP buffer) etanol.
3. Futeni kolonën përsëri në tubin e grumbullimit, transferojeni përzierjen në kolonë, centrifugoni në 12,000 rpm (13,800 ×g) për 30 – 60 sek.Nëse vëllimi i tretësirës së përzier është >700 µL, vendoseni kolonën e përthithjes përsëri në tubin e grumbullimit, transferoni tretësirën e mbetur në kolonën e përthithjes dhe centrifugoni në 12,000 rpm (13,800 × g) për 30 – 60 sekonda.
4. Performanca e radhës i referohet hapit 5 – 8 të programit të nxjerrjes 08- 1/Xhel.
Aplikacionet
Përqendrime të ndryshme të xhelit të agarozës TAE ose TBE;Produkte PCR, sisteme të reaksionit enzimatik ose produkte të tjera të papërpunuara të ADN-së të marra me metoda të ndryshme.Fragmentet e gjetura varionin nga70 bp -20 kb.
Shënime
Vetëm për përdorim kërkimor.Jo për përdorim në procedurat diagnostike.
1. Shtoni 80 ml etanol për të holluar Buffer GW siç tregohet në etiketë përpara përdorimit, ruajeni në temperaturën e dhomës.
2. Nëse Buffer GDP është e lehtë të precipitohet gjatë ruajtjes në temperaturë të ulët, ai mund të vendoset në temperaturën e dhomës për një periudhë kohe përpara përdorimit.Nëse është e nevojshme, mund të nxehet paraprakisht në një banjë uji 37℃ derisa precipitati të tretet plotësisht dhe më pas mund të përdoret pas përzierjes.
3. Vendoseni temperaturën e banjës me ujë në 50 ~ 55℃ paraprakisht.
4. Në hapin 1 të programit të nxjerrjes 08-1/Gel, minimizimi i madhësisë së fetës së xhelit do të reduktojë ndjeshëm kohën e tretjes dhe do të rrisë efikasitetin e rikuperimit (ADN-ja e linearizuar hidrolizohet lehtësisht kur ekspozohet vazhdimisht në temperaturë të lartë).Mos e ekspozoni xhelin e ADN-së në UV për një kohë të gjatë, pasi drita ultravjollcë mund të shkaktojë dëmtim të ADN-së.
5. Shpërndani plotësisht xhelin në hapin 2 të programit të nxjerrjes 08- 1/Xhel, përndryshe efikasiteti i rikuperimit të ADN-së do të ndikohet seriozisht.
6. Ngrohni paraprakisht tamponin e elucionit ose ddH2O në 55℃, i cili është i dobishëm për të përmirësuar efikasitetin e elucionit të ADN-së.Rekomandohet ruajtja e ADN-së në eluent prej 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
