Uracil ADN Glikozilaza
Uracil-ADN Glycosylase (UNG ose UDG) është një klon rekombinant i E.coli me një peshë molekulare prej 25 kDa.Katalizon lirimin e uracilit të lirë nga ADN-ja me një fije dhe dyvargje që përmban uracil dhe është joaktiv ndaj ARN-së dhe mund të përdoret për të parandaluar ndotjen e produkteve të amplifikimit PCR.Parimi i veprimit bazohet në faktin se nëse dUTP zëvendësohet me dTTP në reaksionin PCR dhe formohet një produkt i amplifikimit PCR që përmban baza dU, enzima mund të thyejë në mënyrë selektive lidhjen glikozidike të bazave U në një dhe me dy fije floku. ADN dhe degradojnë produktin e amplifikimit PCR.
Aplikimi i rekomanduar
Përforcimi i parandalimit të kontaminimit
Gjendja e ruajtjes
-20°C për ruajtje afatgjatë, duhet të përzihet mirë para përdorimit, të shmanget ngrirja-shkrirja e shpeshtë.
Buferi i ruajtjes
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizues, 50% Glicerol.
Përkufizimi i njësisë
Sasia e enzimës që kërkohet për të degraduar 1 μg ADN me një fije floku që përmban baza dU në 1 orë në 37°C është 1 njësi.
Kontrolli i cilësisë
1.Pastërti elektroforetike SDS-PAGE më e madhe se 98%
2.Ndjeshmëria e amplifikimit, kontrolli nga grupi në grup, stabiliteti
3.Pasi 1U UNG trajtohet në 50℃ për 2 minuta, shablloni që përmban U nën 103 kopje duhet të degradohet plotësisht dhe nuk mund të prodhohet asnjë produkt përforcues.
4.Nuk ka aktivitet ekzogjen nukleaza
Udhëzimet
| Komponentët | Vëllimi (μL) | Përqendrimi përfundimtar |
| 10 × PCR Bufer (dNTP pa, Mg²+falas) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (zëvendësoni dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Përzierja e primerita | 2 | 1× |
| shabllon | - | ＜1μg/reaksion |
| ddH2O | Deri në 50 | - |
Shënim: a: Nëse përdoret për qPCR/qRT-PCR, sonda fluoreshente duhet të shtohet në sistemin e reagimit.Zakonisht, një përqendrim përfundimtar i primerit prej 0.2 μM mund të japë rezultate të mira;kur performanca e reaksionit është e dobët, përqendrimi i primerit mund të rregullohet në intervalin 0,2-1 μM.Zakonisht, përqendrimi i sondës optimizohet në intervalin 0,1-0,3 μM.Eksperimentet e gradientit të përqendrimit mund të kryhen për të gjetur kombinimin më të mirë të primerit dhe sondës.
Shënime
1.Enzima UNG mund të përdoret për të hequr produktet e kontaminuara të amplifikimit dUTP nga sistemi i reagimit përpara reaksionit të amplifikimit PCR, pastaj për të shmangur rezultatet false-pozitive për shkak të kontaminimit të produktit.
2.Temperatura optimale për enzimën UNG që do të përdoret në reaksionin PCR kundër kontaminimit është përgjithësisht 50℃ për 2 minuta;gjendja e çaktivizimit është 95℃ për 5 minuta.
3.Shmangni ngrirje-shkrirjen e shpeshtë dhe mos e ekspozoni ndaj luhatjeve të mëdha të temperaturës.
4.Gjene të ndryshme që do të amplifikohen kanë efikasitet të ndryshëm të përdorimit të dUTP dhe ndjeshmëri ndaj enzimës UNG, prandaj, nëse përdorimi i sistemit UNG çon në një ulje të ndjeshmërisë së zbulimit, sistemi i reagimit duhet të rregullohet dhe optimizohet, nëse keni nevojë për mbështetje teknike, ju lutemi kontaktoni Kompania jone.
