UNG i ndjeshëm ndaj temperaturës
Temperature Sensitive UNG (TS-UNG) është një shprehje rekombinante e marrë në E. coli.Enzima katalizon lirimin e uracilit të lirë nga ADN-ja me një dhe dyvargje që përmban uracil dhe është joaktive ndaj ARN-së.Krahasuar me enzimën konvencionale UNG me origjinë të gjenit E. coli, enzima TS-UNG ka aktivitet më të lartë në temperatura të ulëta (20℃~37℃) dhe është e ndjeshme ndaj temperaturës dhe çaktivizohet lehtësisht (50℃), duke shmangur degradimin e amplifikimit që përmban dUTP produkte në temperaturën e dhomës nga aktiviteti i mbetur që mund të mbetet pas inaktivizimit të enzimës konvencionale UNG.Prandaj, enzima TS-UNG nuk është vetëm e përshtatshme për reaksionin e parandalimit të kontaminimit PCR, por gjithashtu përputhet mirë me programin e amplifikimit RT-PCR dhe mund të përdoret në reaksionin e parandalimit të kontaminimit RT-PCR.
Aplikimi i rekomanduar
Përforcimi i parandalimit të kontaminimit
Gjendja e ruajtjes
-20°C për ruajtje afatgjatë, duhet të përzihet mirë para përdorimit, të shmanget ngrirja-shkrirja e shpeshtë.
Buferi i ruajtjes
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizues, 50% Glicerol.
Përkufizimi i njësisë
Sasia e enzimës që kërkohet për të degraduar 1 μg të ADN-së me një zinxhir që përmban baza dU në 1 orë në 37°C është 1 njësi aktiviteti (U).
Kontrolli i cilësisë
1.Pastërti elektroforetike SDS-PAGE më e madhe se 98%
2.Aktiviteti i degradimit, kontrolli nga grupi në grup, stabiliteti
3.Nuk ka aktivitet ekzogjen nukleaza, nuk ka endonukleazë ekzogjene ose kontaminim ekzonukleazë.
Udhëzimet
| Komponentët | Vëllimi (μL) | Përqendrimi përfundimtar |
| 10 × PCR Buffer (dNTP pa, Mg²+falas) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (zëvendësoni dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1,25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0,5 (0,1-0,5) | 0,5 U (0,1-0,5 U) |
| 25 × Përzierja e primerita | 2 | 1× |
| shabllon | - | ＜1μg/reaksion |
| ddH2O | Deri në 50 | - |
Shënim: a: Nëse përdoret për qPCR/qRT-PCR, sonda fluoreshente duhet të shtohet në sistemin e reagimit.Zakonisht, një përqendrim përfundimtar i primerit prej 0.2 μM mund të japë rezultate të mira;kur performanca e reaksionit është e dobët, përqendrimi i primerit mund të rregullohet në intervalin 0,2-1 μM.Zakonisht, përqendrimi i sondës optimizohet në intervalin 0,1-0,3 μM.Eksperimentet e gradientit të përqendrimit mund të kryhen për të gjetur kombinimin më të mirë të primerit dhe sondës.
Shënime
1.Temperatura optimale e reagimit të enzimës TS-UNG është relativisht e ulët dhe mund të optimizohet në intervalin 20℃~37℃, doza e enzimës dhe koha e reagimit mund të optimizohen në intervalin 0,1~0,5 U, 5~ 10 min;dhe enzima mund të inaktivizohet në procesin e transkriptimit të kundërt.
2.Është i përshtatshëm për PCR dhe RT-PCR për të parandaluar kontaminimin.
3.Shmangni ngrirje-shkrirjen e shpeshtë dhe mos e ekspozoni ndaj luhatjeve të mëdha të temperaturës.
4.Gjene të ndryshme që do të amplifikohen kanë efikasitet të ndryshëm të përdorimit të dUTP dhe ndjeshmëri ndaj enzimës UNG, prandaj, nëse përdorimi i sistemit UNG çon në një ulje të ndjeshmërisë së zbulimit, sistemi i reagimit duhet të rregullohet dhe optimizohet, nëse keni nevojë për mbështetje teknike, ju lutemi kontaktoni Kompania jone.
