M-MLV Transkriptaza e kundërt
RevScript Transkriptaza e kundërt përftohet nga teknologjia e inxhinierisë gjenetike.Ka aftësi më të lartë të sintezës së cADN-së, qëndrueshmëri termike dhe kufi të temperaturës së reagimit (deri në 60°C).Produkti cDNA i sintetizuar është deri në 10 kb.Ai rrit afinitetin e shablloneve dhe është i përshtatshëm për transkriptimin e kundërt të shablloneve të ARN-së me strukturë komplekse dytësore ose gjene me kopje të ulët.
Komponentët
| Komponenti | HC2003B (10,000 U) | HC2003B (5*10,000 U) | HC2003B (200,000 U) |
| RevScript Reverse Transkriptaza (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Gjendja e ruajtjes
Ky produkt duhet të ruhet në -25°C~-15°C për 2 vjet.
Përkufizimi i njësisë
Një njësi përfshin 1 nmol dTTP në materialin e patretshëm në acid në 10 minuta në 37°C duke përdorur Oligo(dT) si abetare.
Konfigurimi i reagimit
1.Denatyrimi i shabllonit të ARN-së (Ky hap është opsional, denatyrimi i shabllonit të ARN-së ndihmon në hapjen e strukturave dytësore, të cilat do të përmirësojnë rendimentin e cDNA-së së vargut të parë.)
| Komponentët | Vëllimi (μL) |
| RNase pa ddH2O | Deri në 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) ose Primer i rastësishëm (50 μmol/L) Ose Primerë specifikë për gjenet (2 μmol/L) | 1 |
| ose 1 | |
| ose 1 | |
| shabllon i ARN-së | X a |
Shënime:
1) a: ARN totale: 1-5 ug ose mARN: 1-500 ng
2) Inkuboni në 65°C për 5 minuta, më pas transferojeni në akull menjëherë për të ftohur për 2 minuta.Centrifugim i shkurtër për të mbledhur lëngun e reaksionit, shtoni tretësirën e reaksionit të transkriptimit të kundërt siç tregohet në tabelën e mëposhtme.Hidhni butësisht me pipetë për t'u përzier.
1.Përgatitja e përzierjes së reaksionit (vëllimi 20 μL)
| Komponentët | Vëllimi (μL) |
| Përzierja e hapit të mëparshëm | 13 |
| 5× Tampon | 4 |
| Përzierje dNTP (10 nmol/L) | 1 |
| Transkriptaza e kundërt (200 U/μL) | 1 |
| Frenues i RNazës (40 U/μL) | 1 |
1.Kryeni reagimin në kushtet e mëposhtme:
| Temperatura (°C) | Koha |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 minuta |
| 85 °Cc | 5 min |
Shënime:
1) a.Inkubimi në 25°C për 5 minuta kërkohet vetëm për përdorimin e heksamerëve të rastësishëm.Ju lutemi, kaloni këtë hap kur përdorni Oligo (dT)18ose Gene Specific Primer.
2) b.Temperatura e rekomanduar e transkriptimit të kundërt është 42°C, për shabllonet me struktura dytësore të ndërlikuara ose përmbajtje të lartë GC, rekomandohet të ngrihet temperatura e reagimit në 50-55°C.
3) c.Ngrohja në 85°C për 5 minuta për të çaktivizuar transkriptazën e kundërt.
4) Produkti mund të përdoret drejtpërdrejt në reaksionet PCR ose qPCR, ose të ruhet në -20°C për ruajtje afatshkurtër.Rekomandohet që produktet të bashkohen dhe të ruhen në -80°C për ruajtje afatgjatë.Shmangni ngrirje-shkrirjen e shpeshtë.
5) Produkti është i përshtatshëm për RT-qPCR me një hap, rekomandohet të shtoni 10-20 U transkriptazë të kundërt për çdo sistem reaksioni 25μL, ose të rritni gradualisht sasinë e transkriptazës së kundërt sipas situatës aktuale.
Shënime
1.Ju lutemi mbani të pastër zonën eksperimentale;Gjatë operimit duhet të vishen doreza dhe maska të pastra.Të gjitha materialet harxhuese të përdorura në eksperiment duhet të jenë pa RNase për të parandaluar kontaminimin me RNase.
2.Të gjitha procedurat duhet të kryhen në akull për të parandaluar degradimin e ARN-së.
3.Rekomandohen mostra të ARN-së me cilësi të lartë për të siguruar efikasitet të lartë të transkriptimit të kundërt.
4.Ky produkt është vetëm për përdorim kërkimor.
5.Ju lutemi veproni me veshje laboratori dhe doreza njëpërdorimshe, për sigurinë tuaj.
