5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Numri i maceve: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) është një përzierje shumë e qëndrueshme e bazuar në sonda me një tub, e përshtatshme për transkriptimin e kundërt me një hap dhe PCR sasiore (qRT-PCR).Mbështet parapërzierjen e primerëve dhe sondave dhe qëndron i qëndrueshëm pas ruajtjes për një kohë të gjatë në temperaturë të ulët.Mostra që do të testohet mund të shtohet drejtpërdrejt kur përdoret, pa hapje shtesë të tubit/përdorim tubash.Ky produkt ofron komponentë, p.sh. ADN polimerazë me fillim të nxehtë, M-MLV, glikozilazë e uracilit të ADN-së të qëndrueshme ndaj nxehtësisë (TS-UNG), frenues i RNase, MgCl2, dNTP (me dUTP në vend të dTTP) dhe stabilizues.Me transkriptazën e kundërt të amplifikimit të shpejtë gjenetikisht të modifikuar dhe polimerazën e ADN-së, është e mundur të përfundoni amplifikimin PCR brenda 20-40 minutave.Ky reagent përdor tampon special për qPCR me enzima të përziera të enzimës së amplifikimit anti-inhibitor dhe enzimës UNG.Prandaj, ai mund të marrë një amplifikim të mirë të gjeneve të synuara dhe të parandalojë amplifikimin e rremë të shkaktuar nga ndotja e mbetur nga PCR dhe aerosol.Ky reagent është i pajtueshëm me shumicën e instrumenteve PCR sasiore me fluoreshencë nga prodhues të tillë si Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad dhe Roche.
Komponenti
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Kushtet e ruajtjes
Të gjithë përbërësit duhet të mbahen në -20℃ për ruajtje afatgjatë dhe 4℃ deri në 3 muaj.Ju lutemi përzieni tërësisht pas shkrirjes dhe centrifugoni përpara përdorimit.Shmangni ngrirje-shkrirjen e shpeshtë.
Përgatitja e sistemit të reagimit qRT-PCR
| Komponentët | 25μLSistemi | 50μLSistemi | Përqendrimi përfundimtar |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2 μL | 1× |
| ARN shabllonb | - | - | - |
| ddH2O | Deri në 25 μL | Deri në 50 μL | - |
1) a. Përqendrimi përfundimtar i abetares është zakonisht 0.2μM.Për rezultate më të mira, përqendrimi i primerit mund të optimizohet brenda intervalit 0.2-1μM.Në përgjithësi, përqendrimi i sondës mund të optimizohet brenda intervalit 0.1-0.3μM.
2) b. Kur përdorni një procedurë të shpejtë PCR, rritja e përqendrimit të primerëve dhe sondave mund të rezultojë në rezultate më të mira të amplifikimit dhe raporti i tyre duhet të optimizohet në përputhje me rrethanat.
3) Llojet e ndryshme të mostrave përmbajnë lloje dhe përmbajtje të ndryshme të inhibitorit dhe numrit të kopjes së gjenit të synuar.Vëllimi i mostrës duhet të merret parasysh nga gjendja aktuale.Nëse është e nevojshme, bëni një hollim të kampionit me ujë pa nukleazë ose TE Buffer.
Reagimi Ckushtet
| Procedura e rregullt PCR | Procedura e shpejtë PCR | ||||||
| Procedura | Temp. | Koha | Cikli | Procedura | Temp. | Koha | Cikli |
| Transkriptimi i kundërt | 50 ℃ | 10-20 minuta | 1 | Transkriptimi i kundërt | 50 ℃ | 5 min | 1 |
| Polimeraza Aktivizimi | 95 ℃ | 1-5 minuta | 1 | Polimeraza Aktivizimi | 95 ℃ | 30-ta | 1 |
| Denatyrimi | 95 ℃ | 10-20 | 40-50 | Denatyrimi | 95 ℃ | 1-3 sekonda | 40-50 |
| Pjekja dhe Zgjerim | 56-64 ℃ | 20-60 | Pjekja dhe Zgjerim | 56-64 ℃ | 3-20 | ||
Kontrolli i cilësisë
1.Zbulimi i funksionit: ndjeshmëria, specifika dhe përsëritshmëria e qPCR.
2.Nuk ka aktivitet ekzogjen nukleaza: nuk ka endonukleazë ekzogjene dhe ndotje ekzonukleaze.
Shënime
1.Shkalla e amplifikimit të polimerazës së shpejtë të ADN-së është jo më pak se 1 kb/10s.Instrumente të ndryshme PCR kanë shpejtësi të ndryshme ngrohjeje dhe ftohjeje, mënyra të kontrollit të temperaturës dhe përçueshmëri termike, dhe kështu optimizimi i përqendrimit të primerit/sondës dhe metodës së funksionimit në kombinim me instrumentin tuaj specifik të shpejtë PCR është thelbësor.
2.Ky produkt ka një aplikim të gjerë dhe është i përshtatshëm për diagnostikimin molekular me ndjeshmëri të lartë.Metoda PCR me tre hapa rekomandohet për primerët me temperaturë të ulët pjekjeje ose për amplifikimin e fragmenteve të gjata mbi 200 bp.
3.Meqenëse amplikonët e ndryshëm kanë efikasitet të ndryshëm të përdorimit të dUTP dhe ndjeshmëri të ndryshme ndaj UNG, reagentët duhet të optimizohen nëse ndjeshmëria e zbulimit zvogëlohet kur përdoret sistemi UNG.Ju lutemi na kontaktoni për mbështetje teknike nëse është e nevojshme.
4.Për të shmangur amplifikimin e produkteve PCR të bartjes, kërkohet një zonë eksperimentale e dedikuar dhe një pipetë për amplifikimin.Punoni me doreza dhe ndërroni shpesh dhe mos e hapni tubin PCR pas amplifikimit.
