Enzima mbuluese e virusit Vaccinia

Enzima mbuluese e virusit Vaccinia rrjedh nga një shtam rikombinant E. coli që mbart gjenet për enzimën mbuluese të Vaccinia.Kjo enzimë e vetme përbëhet nga dy nënnjësi (D1 dhe D12) dhe ka tre aktivitete enzimatike (ARN trifosfataza dhe guanililtransferaza nga nënnjësia D1 dhe guanine metiltransferaza nga nënnjësia D12).Enzima mbuluese e virusit vaccinia është efektive për të katalizuar formimin e strukturës së kapakut, e cila mund të bashkojë në mënyrë specifike strukturën e kapakut 7-metilguanilate (m7Gppp, Kapak 0) në skajin 5' të ARN-së.Struktura e kapakut (Cap 0) luan një rol të rëndësishëm në stabilizimin, transportin dhe përkthimin e mRNA në eukariotët.Mbyllja e ARN-së me reaksion enzimatik është një metodë efektive dhe e thjeshtë e cila mund të përmirësojë ndjeshëm stabilitetin dhe përkthimin e ARN-së për transkriptimin in vitro, transfeksionin dhe mikroinjektimin.

Komponentët

Enzima mbuluese e virusit Vaccinia (10 U/μL)

10× Tampon mbulues

Kushtet e ruajtjes

-25～- 15℃ për ruajtje (Shmangni ciklet e përsëritura të ngrirjes-shkrirjes)

Buferi i ruajtjes

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glicerinë.

Përkufizimi i njësisë

Një njësi e enzimës mbuluese të virusit Vaccinia përcaktohet si sasia e enzimës që kërkohet për të inkorporuar 10pmol GTP në një transkript 80nt në 1 orë në 37°C.

Kontrolli i cilësisë

Eksonukleaza:10 U enzimë mbuluese të virusit Vaccinia me 1μg λ-Hind III ADN e tretur në 37 ℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

Endonukleaza:10 U enzimë mbuluese të virusit Vaccinia me 1μg λDNA në 37℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

Nickase:10 U enzimë mbuluese të virusit Vaccinia me 1 μg pBR322 në 37 ℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza me xhel agarozë.

RNase:10 U enzimë mbuluese të virusit Vaccinia me 1.6μg MS2 ARN për 4 orë në 37℃ nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

1.coli ADN:10U e Enzimës mbuluese të virusit Vaccinia ekzaminohet për praninë e ADN-së gjenomike të E. coli duke përdorur TaqMan qPCR me primerë specifikë për vendndodhjen e E. coli 16S rRNA.Kontaminimi i ADN-së gjenomike të E. coli është gjenomi ≤1 E. coli.

2.Bakterike Endotoksina: Testi LAL, sipas botimit Kinez Farmakopeja IV 2020, metoda e testit të kufirit të xhelit, rregull i përgjithshëm (1143).Përmbajtja e endotoksinës bakteriale duhet të jetë ≤10 EU/mg.

Sistemi dhe kushtet e reagimit

1. Protokolli i mbulimit (vëllimi i reagimit: 20 μL)

Kjo procedurë është e zbatueshme për reaksionin mbulues të 10μg ARN (≥100 nt) dhe mund të rritet sipas kërkesave eksperimentale.

I) Kombinoni 10 μg ARN dhe H2O pa nukleaza në një tub mikrofuge 1,5 ml në një vëllim përfundimtar prej 15,0 µL.*10× Tampon mbulues: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) Ngroheni në 65℃ për 5 minuta dhe më pas bëni banjë akulli për 5 minuta.

3) Shtoni komponentët e mëposhtëm në rendin e specifikuar

*10× Tampon mbulues: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) Inkuboni në 37°C për 30 minuta, ARN tani është mbyllur dhe gati për aplikime në rrjedhën e poshtme.

2. Terminali 5′ reagimi i etiketimit (vëllimi i reagimit: 20 μL)

Ky protokoll është krijuar për të etiketuar ARN që përmban një trifosfat 5' dhe mund të rritet sipas kërkesave.Efikasiteti i inkorporimit të etiketës do të ndikohet nga raporti molar i ARN: GTP, si dhe përmbajtja e GTP në mostrat e ARN-së.

1) Kombinoni sasinë e duhur të ARN-së dhe H2O pa nukleazë në një tub mikrofuge 1,5 ml deri në një vëllim përfundimtar prej 14,0 µL.

2) Ngroheni në 65℃ për 5 minuta dhe më pas bëni banjë akulli për 5 minuta.

3) Shtoni komponentët e mëposhtëm në rendin e specifikuar.

** GTP MIX i referohet GTP dhe një numri të vogël shënuesish.Për përqendrimin e GTP, referojunite Shënimi 3.

4) Inkuboni në 37°C për 30 minuta, fundi ARN 5' tani është etiketuar dhe gati për në rrjedhën e poshtme

Aplikacionet

1. Mbulimi i mARN-së përpara analizave të përkthimit/përkthimit in vitro

2. Etiketimi i skajit 5' të mARN

Shënime mbi përdorimin

1.Ngrohja e tretësirës së ARN-së përpara inkubimit me enzimën mbuluese të Vaccinia heq strukturën dytësore në fundin 5' të transkriptit.Zgjatni kohën në 60 minuta për transkriptet me 5'funde të njohura shumë të strukturuara.

2. ARN-ja e përdorur për reaksionet e mbulimit duhet të pastrohet përpara përdorimit dhe të pezullohet në ujë pa nukleaza.EDTA nuk duhet të jetë e pranishme dhe tretësira duhet të jetë pa kripëra.

3. Për etiketimin e skajit 5', përqendrimi total i GTP duhet të jetë rreth 1-3 herë më i madh se përqendrimi molar i mRNA në reaksion.

4. Vëllimi i sistemit të reaksionit mund të zvogëlohet lart ose poshtë sipas aktualit.