PNGaza F
Peptid-N-glikozidaza F(PNGaza F) është metoda më efektive enzimatike për heqjen e pothuajse të gjitha oligosakarideve të lidhura me N nga glikoproteinat.PNGaza F është një amidase, e cila shkëputet midis mbetjeve më të brendshme të GlcNAc dhe asparaginës të oligosakarideve të larta të manozës, hibride dhe komplekse nga glikoproteinat e lidhura me N.
Aplikacion
Kjo enzimë është e dobishme për largimin e mbetjeve të karbohidrateve nga proteinat.
Përgatitja dhe specifikimi
| Pamja e jashtme | Lëng pa ngjyrë |
| Pastërtia e proteinave | ≥95% (nga SDS-PAGE) |
| Aktiviteti | ≥500,000 U/mL |
| Ekzoglikozidaza | Asnjë aktivitet nuk mund të zbulohej (ND) |
| Endoglikozidaza F1 | ND |
| Endoglikozidaza F2 | ND |
| Endoglikozidaza F3 | ND |
| Endoglikozidaza H | ND |
| Proteaza | ND |
Vetitë
| Numri EC | 3.5.1.52(Rekombinant nga mikroorganizmat) |
| Peshë molekulare | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Pika izoelektrike | 8. 14 |
| PH optimale | 7,0-8,0 |
| Temperatura optimale | 65 °C |
| Specifikimi i substratit | Thyerja e lidhjeve glikozidike midis mbetjeve të GlcNAc dhe asparaginës Fig.1 |
| Vendet e njohjes | Glikane të lidhura me N nëse nuk përmbajnë α1-3 fukozë Fig. 2 |
| Aktivizuesit | DTT |
| Frenues | SDS |
| Temperatura e ruajtjes | -25 ~ -15 ℃ |
| Inaktivizimi i nxehtësisë | Një përzierje reaksioni prej 20 µL që përmban 1 µL PNGase F çaktivizohet me inkubacion në 75 °C për 10 minuta. |
Fig. 1 Specifikimi i substratit të PNGazës F
Fig. 2 Njohja qëndron e PNGase F.
Kur mbetjet e brendshme të GlcNAc lidhen me fukozën α1-3, PNGaza F nuk mund të ndajë oligosakaridet e lidhura me N nga glikoproteinat.Ky modifikim është i zakonshëm në bimë dhe në disa glikoproteina të insekteve.
Ckomponentët
|
| Komponentët | Përqendrimi |
| 1 | PNGaza F | 50 µl |
| 2 | 10× Tampon denatyrues i glikoproteinës | 1000 µl |
| 3 | 10×Glikobufer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Përkufizimi i njësisë
Një njësi (U) përcaktohet si sasia e enzimës që kërkohet për të hequr > 95% të karbohidrateve nga 10 µg RNase B të denatyruar në 1 orë në 37°C në një vëllim reaksioni total prej 10 µL.
Kushtet e reagimit
1. Tretni 1-20 µg glikoproteinë me ujë të dejonizuar, shtoni 1 µl 10 × glikoproteinë tampon denatyrues dhe H2O (nëse është e nevojshme) për të bërë një vëllim total reaksioni prej 10 µl.
2.Inkuboni në 100°C për 10 minuta, ftoheni në akull.
3.Shtoni 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 dhe përzieni.
4.Shtoni 1-2 µl PNGase F dhe H2O (nëse është e nevojshme) për të bërë një vëllim total të reagimit prej 20 µl dhe përzieni.
5.Reaksioni inkubohet në 37°C për 60 min.
6.Për analizën SDS-PAGE ose analizë HPLC.
