mARN Kap2'-O-Metiltransferaza

mARN Cap 2' -O-metiltransferaza u përftua nga një shtam rekombinant E. coli që mbart gjenin për kapak 2 '-O-Metiltransferazën mRNA të vaccinia.Kjo enzimë shton një grup metil në pozicionin 2'-O të nukleotidit të parë ngjitur me strukturën e kapakut në skajin 5' të ARN-së. Enzima përdor S-adenozilmetioninë (SAM) si një dhurues metil për të metiluar ARN-në e mbuluar (kapak -0) duke rezultuar në një strukturë cap- 1.

Struktura Cap1 mund të rrisë efikasitetin e përkthimit, duke përmirësuar shprehjen e mRNA në eksperimentet e transfektimit dhe mikroinjektimit. Kjo enzimë kërkon në mënyrë specifike ARN me një kapak m7GpppN si substrat.Nuk mund të përdorë ARN me pN, ppN, pppN ose GpppN në fundin 5'.ARN-ja me kapak mund të përgatitet nëpërmjet transkriptimit in vitro duke përdorur analog me kapak ose nëpërmjet mbulimit enzimatik duke përdorur enzimën mbuluese të Vaccinia.

Komponentët

Kapaku i mRNA 2´-O-Metiltransferaza (50U/μL)

10× Tampon reaksioni mbulues

Magazinimi

-25 ～- 15 ℃ për ruajtje (Shmangni ciklet e përsëritura të ngrirjes-shkrirjes)

Buferi i ruajtjes

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X- 100, 50% glicerinë.

Përkufizimi i njësisë

Një njësi përcaktohet si sasia e enzimës që kërkohet për të metiluar 10 pmoles të transkriptit të ARN-së me kapak 80 nt në 1 orë në 37°C.

Vlerësimet e kontrollit të cilësisë

Eksonukleaza:50U e mARN Kap 2'-O-Metiltransferazë me 1μg λ-Hind III ADN e tretur në 37 ℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

Endonukleaza: 50 U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase me 1 μg λDNA në 37℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

Nickase: 50U mARN Cap 2´-O-Methyltransferase me 1μg pBR322 në 37 ℃ për 16 orë nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

RNase: 50 U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase me 1.6μg MS2 ARN për 4 orë në 37℃ nuk jep degradim siç përcaktohet nga elektroforeza e xhelit të agarozës.

E. coli ADN: 50U mARN Kap 2´-O-Metiltransferazë ekzaminohet për praninë eE. coli ADN gjenomike duke përdorur TaqMan qPCR me primerë specifikë përE. coli Lokusi 16S rRNA.TëE. coli kontaminimi gjenomik i ADN-së është =1E. coli gjenomi.

Bakterike Endotoksina: Testi LAL, sipas botimit Kinez Farmakopeja IV 2020, metoda e testit të kufirit të xhelit, rregull i përgjithshëm (1143).Përmbajtja e endotoksinës bakteriale duhet të jetë =10 EU/mg.

Sistemi dhe kushtet e reagimit

1. Kombinoni një sasi të përshtatshme të ARN-së me kapak dhe H2O pa RNazë në një tub mikrofuge 1,5 mL deri në një vëllim përfundimtar prej 16,0 µL.

2. Ngroheni në 65℃ për 5 minuta dhe më pas bëni një banjë akulli për 5 minuta.

3. Shtoni përbërësit e mëposhtëm në rendin e specifikuar (për metilimin e ARN-së së mbuluar

më pak se 10

*10× Buferi i reagimit mbulues: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkuboni në 37℃ për 1 orë (2 orë inkubacion rekomandohet për fragmentin e synuar më pak se 200 nt).

Aplikacionet

Për të përmirësuar shprehjen e mRNA gjatë eksperimenteve të mikroinjektimit dhe transfektimit.

Shënime mbi përdorimin

1. Para reagimit, ARN duhet të pastrohet dhe të shpërndahet në ujë pa nukleazë, të gjitha tretësirat nuk duhet të përmbajnë asnjë EDTA dhe jone.

2. Rekomandohet të ngrohni ARN-në e mostrës në 65℃ për 5 minuta përpara reaksionit për të hequr strukturën dytësore në fundin 5' të transkriptit.Mund të zgjatet deri në 10 minuta për strukturën komplekse të terminalit 5'.