M-MLV Neoscript Reverse Transkriptaza
Neoscript Reverse Transcriptase është një transkriptazë e kundërt e marrë nga skriningu i mutacionit të gjenit M-MLV të origjinës dhe shprehjes së virusit të leuçemisë së murinës Moloney në E.coli.Enzima heq aktivitetin e RNase H, ka tolerancë më të lartë ndaj temperaturës dhe është e përshtatshme për transkriptim të kundërt në temperaturë të lartë.Prandaj, është e dobishme për eliminimin e efekteve të pafavorshme të strukturës së nivelit të lartë të ARN-së dhe faktorëve jospecifik në sintezën e cADN-së, dhe ka stabilitet më të lartë dhe aftësi sintetike të transkriptimit të kundërt.Enzima ka stabilitet më të lartë dhe aftësi të sintezës së transkriptimit të kundërt.
Komponentët
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Buffer me fillesën e parë (opsionale)
* 5 × Buferi i fillesës së parë nuk përmban dNTP, ju lutemi shtoni dNTP kur përgatitni sistemin e reagimit
Aplikimi i rekomanduar
1.QRT-PCR me një hap.
2.Zbulimi i virusit ARN.
Gjendja e ruajtjes
-20°C për ruajtje afatgjatë, duhet të përzihet mirë para përdorimit, të shmanget ngrirja-shkrirja e shpeshtë.
Përkufizimi i njësisë
Një njësi përfshin 1 nmol dTTP në 10 minuta në 37°C duke përdorur poli(A)•oligo(dT)25si shabllon/abetare.
Kontrolli i cilësisë
1.Pastërtia elektroforetike SDS-PAGE më e madhe se 98%.
2.Ndjeshmëria e amplifikimit, kontrolli nga grupi në grup, stabiliteti.
3.Nuk ka aktivitet ekzogjen nukleaza, nuk ka endonukleazë ekzogjene ose kontaminim ekzonukleazë
Konfigurimi i reagimit për zgjidhjen e reaksionit të zinxhirit të parë
1.Përgatitja e përzierjes së reaksionit
| Komponentët | Vëllimi |
| Oligo(dT)12-18 Abetare ose Random Primera Ose primerët specifikë të gjeneveb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| ARN shabllon | ARN total≤ 5μg;mARN≤ 1 μg |
| dH pa RNase2O | Deri në 10 μL |
Shënime:a/b: Ju lutemi zgjidhni lloje të ndryshme abetaresh sipas nevojave tuaja eksperimentale.
2.Ngroheni në 65°C për 5 minuta dhe ftoheni shpejt në akull për 2 minuta.
3.Shtoni përbërësit e mëposhtëm në sistemin e mësipërm në një vëllim total prej 20 µL dhe përzieni butësisht:
| Komponentët | Vëllimi (μL) |
| 5 × Buffer me fillesën e parë | 4 |
| Transkriptaza e kundërt Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Frenues i RNazës (40 U/μL) | 1 |
| dH pa RNase2O | Deri në 20 μL |
4. Ju lutemi kryeni reagimin sipas kushteve të mëposhtme:
(1) Nëse përdoret Primer i rastësishëm, reagimi duhet të kryhet në 25℃ për 10 minuta, dhe më pas në 50℃ për 30 ~ 60 minuta;
(2) Nëse përdoren Oligo dT ose abetare specifike, reagimi duhet të kryhet në 50℃ për 30-60 minuta.
5.Ngroheni në 95℃ për 5 minuta për të çaktivizuar Neoscript Reverse Transcriptase dhe për të përfunduar reagimin.
6.Produktet e transkriptimit të kundërt mund të përdoren drejtpërdrejt në reaksionin PCR dhe reaksionin sasior PCR të fluoreshencës, ose të ruhen në -20℃ për një kohë të gjatë.
PCR Rveprim:
1.Përgatitja e përzierjes së reaksionit
| Komponentët | Përqendrimi |
| 10 × PCR Bufer (pa dNTP, pa Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM çdo dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq ADN Polimeraza (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| shabllona | ≤10% tretësirë e reaksionit të parë zinxhiror (2 μL) |
| ddH2O | Deri në 50 μL |
Shënime:a: Nëse shtohet shumë tretësirë e reaksionit të parë zinxhir, reaksioni PCR mund të frenohet.
2.Procedura e reagimit PCR
| Hapi | Temperatura | Koha | Ciklet |
| Para-denatyrimi | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denatyrimi | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Pjekja | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Zgjerim | 72 ℃ | 10-60 sek |
Shënime
1.I përshtatshëm për optimizimin e temperaturës së transkriptimit të kundërt në rangun prej 42℃~55℃.
2.Ka stabilitet më të mirë, është i përshtatshëm për përforcim të transkriptimit të kundërt me temperaturë të lartë.Përveç kësaj, është i favorshëm për kalimin në mënyrë efikase nëpër rajone komplekse strukturore të ARN-së.Gjithashtu, ajoështë i përshtatshëm për zbulimin sasior të RT-PCR me fluoreshencë multiplekse me një hap.
3.Pajtueshmëri e mirë me enzima të ndryshme të amplifikimit PCR dhe është i përshtatshëm për reaksione RT-PCR me ndjeshmëri të lartë.
4.I përshtatshëm për reaksionin sasior RT-PCR të fluoreshencës me ndjeshmëri të lartë me një hap, përmirëson në mënyrë efektive shkallën e zbulimit të përqendrimit të ulët të shablloneve.
5.I përshtatshëm për ndërtimin e bibliotekës cDNA.
