Kit Maxi Plasmid EndoFree
Ky komplet është i përshtatshëm për ekstraktim nga 150 – 300 ml tretësirë bakteriale të kultivuar gjatë natës, duke përdorur një metodë të përmirësuar të lizës alkaline SDS për lizimin e baktereve.Ekstrakti i papërpunuar kombinohet në mënyrë selektive me një pastrues unik të endotoksinës dhe ndahet me centrifugim për të hequr endotoksinat.Më pas, membrana e xhelit të silicës lidhet në mënyrë selektive me ADN-në plazmidike në tretësirë në kushte me kripë të lartë dhe pH të ulët.Kjo pasohet nga shtimi i tamponit të larjes për të hequr papastërtitë dhe përbërësit e tjerë bakterialë.Së fundi, një tampon elucioni me pak kripë dhe pH të lartë përdoret për të elutur ADN-në e pastër plazmide nga membrana e matricës së silikonit.Membrana e xhelit silicë përdor një membranë të veçantë adsorbimi, dhe diferenca e sasisë së adsorbimit midis kolonës dhe kolonës është shumë e vogël dhe përsëritshmëria është e mirë.Fenoli, kloroformi dhe reagentët e tjerë toksikë nuk kërkohen, dhe as hapat e precipitimit të etanolit.Ky komplet mund të përdoret për të nxjerrë me shpejtësi 0,2 -1,5 mg ADN plazmide të pastër me kopje të lartë, me një shkallë ekstraktimi prej 80% -90%.Kompleti përdor një formulë unike të procesit që heq endotoksinën, përmbajtja e endotoksinës është jashtëzakonisht e ulët dhe efekti i transfektimit të qelizave është i shkëlqyer.Plazmidi i nxjerrë mund të përdoret drejtpërdrejt në tretjen e enzimave, PCR, transkriptimin in vitro, transformimin, sekuencën dhe eksperimente të tjera të biologjisë molekulare.
Kushtet e ruajtjes
RNaseA duhet të ruhet në -30 ~ -15 ℃ dhe të transportohet në ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger mund të ruhet në 2 ~ 8 ℃ për një muaj, të ruhet në -30 ~ -15 ℃ për ruajtje afatgjatëdhe transportohet në ≤0℃.
Komponentët e tjerë duhet të ruhen në temperaturën e dhomës (15 ~ 25 ℃) dhe të transportohen në temperaturën e dhomës.
Komponentët
| Komponentët | 10RXNS |
| RNaza A | 750 μL |
| Buferi P1 | 75 ml |
| Buferi P2 | 75 ml |
| Buferi P4 | 75 ml |
| Pastrues i endotoksinës | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Tampon TB | 20 ml |
| Kolona FastPure ADN Maxi (secila në një tub koleksioni 50 ml) | 10 |
| Tub grumbullimi pa endotoksina | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, përdoret për të hequr ARN.
Buffer P1:tampon suspensioni bakterial, shtoni RNaseA në Buffer P1 përpara përdorimit të parë.
Buffer P2:buferi i lizës bakteriale (që përmban SDS/NaOH).
Buffer P4:tampon neutralizues.
Pastruesi i endotoksinës:heq në mënyrë efektive endotoksinën nga ekstrakti i papërpunuar i plazmidit.
Buffer PW:lani tampon, shtoni vëllimin e përcaktuar të etanolit përpara përdorimit të parë.
Tampon TB:tampon elucioni.
Kolonat Maxi të ADN-së FastPure:kolonat e adsorbimit të ADN-së plazmidike.
Tubat e koleksionit 50 ml:tubat e grumbullimit të filtratit.
Tub grumbullimi pa endotoksina:tubat e grumbullimit të ADN-së plazmide.
Materialet e Përgatitura
Etanol absolut, izopropanol, tuba centrifuge 50 ml me fund të rrumbullakët dhe 50 ml pa endotoksinatuba centrifugues.
Aplikacionet
Ky produkt është i përshtatshëm për nxjerrjen në shkallë të gjerë të plazmideve nga 150 - 300 ml tretësirë bakteriale.kultivuar brenda natës.
Procesi i eksperimentit
1. Merrni 150 – 200 ml (jo më shumë se 300 ml) tretësirë bakteriale të kultivuar gjatë natës dhe centrifugoni nërreth 11,000 rpm (12,000 × g) për 1 – 2 min.Hidhni supernatantin dhe mblidhni bakteret.
Δ Kur mblidhen më shumë se 50 ml tretësirë bakteriale, bakteret mund të mblidhen duke shtuar tretësirë bakteriale, centrifugim, hedhjen e supernatantit dhe hapa të tjerë në të njëjtin tub 50 ml për
shumë herë.
2. Shtoni 7,5 ml buffer P1 (ju lutemi kontrolloni nëse RNaseA është shtuar në bufer P1) në centrifugëtub që përmban baktere dhe përzihet tërësisht me vorbull ose tubacion.
Δ Risuspensioni i plotë i baktereve në këtë hap është kritik për t'u dhënë dhe nuk duhet të ketë grumbullime bakteriale pas risuspensionit.Nëse ka grumbullime bakteriale që nuk janë të përziera plotësisht, kjo do të ndikojë në lizën, duke rezultuar në rendiment dhe pastërti të ulët.Nëse OD600 e tretësirës bakteriale është 0,65, rekomandohet që të përdoren 7,5 ml Buffer P1 kur nxirren nga 150 ml tretësirë bakteriale;kur OD600 është 0,75, duhet të përdoren 8 ml buffer P1 dhe vëllimet e buferëve P2 dhe P4 duhet të ndryshohen në përputhje me rrethanat.Nëse vëllimi i tretësirës bakteriale rritet në 200 ml, rekomandohet që tëvëllimi i tamponëve P1, P2 dhe P4 të rritet proporcionalisht.
3. Shtoni 7,5 ml buffer P2 në suspensionin bakterial nga hapi 2 dhe përzieni butësisht lart e poshtë për 6 – 8herë dhe inkubohen në temperaturën e dhomës për 4 – 5 min.
Δ Përmbyseni butësisht për t'u përzier plotësisht.Vortexing do të shkaktojë fragmentimin e ADN-së gjenomike, duke rezultuar në fragmente të ADN-së gjenomike në plazmidin e nxjerrë.Në këtë kohë, tretësira bëhet viskoze dhe e tejdukshme, duke treguar se bakteret janë lizuar plotësisht.Kohëzgjatja nuk duhet të kalojë 5 minuta për të shmangur shkatërrimin e plazmideve.Nëse tretësira nuk është e qartë, mund të ketë shumë baktere që rezultojnëliza jo e plotë, kështu që sasia e baktereve duhet të reduktohet në mënyrë të përshtatshme.
4. Shtoni 7,5 ml Buffer P4 në suspensionin bakterial nga hapi 3 dhe menjëherë përmbyseni butësisht 6 – 8 herë për të lejuar që solucioni të neutralizojë plotësisht buferin P2.Në këtë kohë, duhet të shfaqet precipitati i bardhë flokulent.Centrifugoni në më shumë se rreth 11,000 rpm (12,000 × g) për 10 – 15 minuta, hidhni me kujdes supernatantin në një tub të ri centrifuge me fund të rrumbullakët 50 ml (i përgatitur vetë) dhe shmangniaspironi precipitatin e bardhë lundrues.
Δ Shtoni buffer P4 dhe menjëherë përmbyseni që të përzihet mirë.Lëreni tubin të qëndrojë derisa precipitati i bardhë të shpërndahet në mënyrë të barabartë në të gjithë tretësirën për të parandaluar prodhimin e reshjeve lokale që mund të ndikojnë në neutralizimin.Nëse nuk ka precipitat uniform të flokulentit të bardhë përpara centrifugimit dhe supernatanti nuk është i qartë pas centrifugimit, tubi mund të jetëcentrifugohet edhe për 5 min.
5. Shtoni 0,1 herë vëllimin (10% të vëllimit të supernatantit, rreth 2,2 ml) të Endotoxin Scavenger në supernatant nga hapi 4 dhe përmbyseni në përzierje.Vendoseni tretësirën në një banjë akulli ose futeni në akull të grimcuar (ose frigorifer në frigorifer) për 5 minuta derisa tretësira të ndryshojë nga e turbullt në e pastër dhe transparente (ose endepak i turbullt), dhe herë pas here përzihet disa herë.
Δ Pasi pastruesi i endotoksinës i shtohet supernatantit, supernatanti do të bëhet i turbullt, porsupernatanti duhet të bëhet i qartë (ose pak i turbullt) pas ftohjes në banjën e akullit.
6. Pasi supernatanti të vendoset në temperaturën e dhomës (>25℃) për 10 – 15 min, ai do të bëhet i turbullt sitemperatura e tij rritet në temperaturën e dhomës.Pastaj sipërfaqja duhet të përmbyset për t'u përzier.
Δ Nëse temperatura e dhomës është më e ulët ose dëshironi të zvogëloni kohën e nxjerrjes, supernatanti mund të inkubohet në një banjë uji 37 ~ 42 ℃ për 5 - 10 minuta dhe hapi tjetër mund të kryhet pas supernatantit.bëhet i turbullt.
7. Centrifugoni supernatantin në rreth 11,000 rpm (12,000 × g) për 10 minuta në temperaturën e dhomës (temperatura duhet të jetë >25℃) për të ndarë fazën.Faza e sipërme ujore përmban ADN-në ndërsa shtresa e poshtme e fazës vajore blu përmban endotoksina dhe papastërti të tjera.TransferoniFaza ujore që përmban ADN në një tub të ri dhehidhni shtresën vajore.
Δ Temperatura gjatë centrifugimit duhet të jetë mbi 25℃ pasi nuk e bën ndarja efektive e fazësndodh nëse temperatura është shumë e ulët.
Δ Nëse ndarja e fazës nuk është efektive, temperatura e centrifugimit mund të rregullohet në 30℃ dhekoha e centrifugimit mund të rritet në 15 min.
Δ Mos e thithni shtresën vajore blu pasi përmban endotoksina dhe papastërti të tjera.
Mekanizmi
Neutralizimi i Lizës së Resuspensionit
◇ Shtoni 7,5 ml bufer P1
◇ Shtoni 7,5 ml bufer P2
◇ Shtoni 7,5 ml bufer P4
Heqja e endotoksinës
◇Shto 0.1 herë vëllimin e supernatantit të Endotoxin Scavenger
Lidhja dhe Larja
◇ Shtoni 0,5 herë vëllimin e izopropanolit
◇ Shtoni 10 ml Buffer PW
◇ Shtoni 10 ml Buffer PW
Elucioni
◇ Shtoni 1 – 2 ml bufer TB ose ddH2O pa endotoksina
