KIT ELISA me ARN me dy vargje (dsRNA).

Ky komplet është një analizë imunosorbente e lidhur me enzimën (ELISA) që lidhet me sistemin biotin-Streptavidin, për matjen sasiore të dsARN-së me gjatësi mbi 60 çifte bazash (bp), pavarësisht nga sekuenca.Pllaka është veshur paraprakisht me antitrupa anti-dsRNA.dsARN e pranishme në kampion shtohet dhe lidhet me antitrupat e veshur në puse.Dhe më pas shtohet antitrupi anti-dsRNA i biotiniluar dhe lidhet me dsARN në kampion.Pas larjes, shtohet HRP-Streptavidin dhe lidhet me antitrupin anti-dsRNA të biotiniluar.Pas inkubacionit HRP-Streptavidina e palidhur lahet.Pastaj shtohet tretësira e substratit TMB dhe katalizohet nga HRP për të prodhuar një produkt me ngjyrë blu që ndryshoi në të verdhë pas shtimit të tretësirës ndaluese acidike.Dendësia e ngjyrës së verdhë është proporcionale me sasinë e synuar të dsRNA të kapur në pjatë.Absorbimi matet në 450 nm.

Aplikacion

Ky komplet është për matjen sasiore të dsARN-së së mbetur.

Komponentët e kompletit

Ruajtja dhe Stabiliteti

1. Për kompletin e papërdorur: I gjithë kompleti mund të ruhet në 2~8℃ në jetëgjatësi.Drita e fortë duhet të shmanget për stabilitetin e ruajtjes.

2. Për kompletin e përdorur: Pasi të hapet mikropllaka, ju lutemi mbuloni pusetat e papërdorura me vulosjen e pjatës dhe kthehuni në qesen me fletë që përmban paketimin e tharësit, mbyllni qesen me fletë metalike me zinxhir dhe kthejeni në 2~8℃ sa më shpejt të jetë e mundur pas përdorimit.Reagentët e tjerë duhet të kthehen në 2~8℃ sa më shpejt të jetë e mundur pas përdorimit.

Materialet e kërkuara por jo të furnizuara

1. Lexues i mikropllakës me filtër 450±10 nm (më mirë nëse mund të zbulohet në gjatësi vale 450 dhe 650 nm).

2. Shaker i mikropllakës.

3. Maja pa RNase dhe tubat centrifugues.

Grafiku i rrjedhës së funksionimit

Perpara se te fillosh

1. Sillni të gjithë përbërësit dhe mostrat e kompletit në temperaturën e dhomës (18-25℃) përpara përdorimit.Nëse kompleti nuk do të përdoret brenda një kohe, ju lutemi hiqni vetëm shiritat dhe reagentët për eksperimentin aktual dhe lini shiritat dhe reagentët e mbetur në gjendjen e kërkuar.

2. Tampon larës: holloni 40 mL bufer larës 20× të koncentruar me 760 ml ujë të dejonizuar ose të distiluar për të përgatitur 800 ml tampon larës 1×.

3. Standard: centrifugoni ose centrifugoni për një kohë të shkurtër solucionin para përdorimit.Përqendrimi i katër standardeve të ofruara është 5ng/μL.Për standardet UTP dhe pUTP dsRNA, ju lutemi holloni tretësirën stoku në 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL me tampon STE për të nxjerrë kurbën standarde.Për standardet N1-Me-pUTP dsRNA, ju lutemi holloni tretësirën stoku në 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 pg/μL me tampon STE për të nxjerrë kurbën standarde.Për standardin dsRNA 5-OMe-UTP, ju lutemi holloni solucionin stoku në 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0 pg/μL me tampon STE për të nxjerrë kurbën standarde.Ne rekomandojmë që standardet të mund të hollohen në grafikët e mëposhtëm:

4. Antitrupat e zbulimit të biotiniluar dhe tretësira e punës HRP-streptavidin: centrifugoni ose centrifugoni për një kohë të shkurtër tretësirën e disponueshme përpara përdorimit.Holloni ato deri në përqendrimin e punës me tampon hollimi.

5. Nënshtresa TMB: aspironi dozën e nevojshme të solucionit me maja të sterilizuara dhe mos e hidhni sërish tretësirën e mbetur në shishkë.Nënshtresa TMB është e ndjeshme ndaj dritës, mos e ekspozoni substratin TMB ndaj dritës për një kohë të gjatë.

Duke përdorur protokollin

1. Përcaktoni numrin e shiritave të nevojshëm për analizën.Futni shiritat në korniza për përdorim.Shiritat e mbetur të pllakave që nuk janë përdorur në këtë analizë duhet të ripaketohen në qese me tharëse.Mbylleni fort qesen për ruajtje në frigorifer.

2. Shtoni 100μL secilin nga hollimet e standardit, të boshllëkut dhe të mostrave në pusetat e duhura.Mbulojeni me vulosjen e pjatës.Inkuboni për 1 orë në temperaturën e dhomës me tundje në 500 rpm.Mostrat duhet të hollohen me tampon STE në përqendrimin e duhur për analizë të saktë.

3. Hapi i larjes: Aspironi tretësirën dhe shpëlajeni me 250μL pufer larës në secilën pus dhe lëreni të qëndrojë për 30 sekonda.Hidhni plotësisht tampon larës duke e këputur pjatën në letër absorbuese.Lani tërësisht 4 herë.

4. Shtoni 100 μL tretësirë ​​të funksionimit të antitrupave të zbulimit të biotiniluar në çdo pus.Mbulojeni me vulosjen e pjatës.Inkuboni për 1 orë në temperaturën e dhomës me tundje në 500 rpm.

5. Përsëritni hapin e larjes.

6. Shtoni 100μL tretësirë ​​pune HRP-streptavidine në çdo pus.Mbulojeni me vulosjen e pjatës.Inkuboni për 30 minuta në temperaturën e dhomës me tundje në 500 rpm.

7. Përsëriteni përsëri hapin e larjes.

8. Shtoni 100μL tretësirë ​​të substratit TMB në çdo pus.Mbulojeni me vulosjen e pjatës.Inkuboni për 30 minuta në RT Mbroni nga drita.Lëngu do të bëhet blu me shtimin e tretësirës së substratit.

9. Shtoni 50 μL tretësirë ​​ndaluese në çdo pus.Lëngu do të bëhet i verdhë me shtimin e tretësirës ndaluese.Më pas përdorni lexuesin e mikropllakës dhe kryeni matjen në 450 nm menjëherë.

Llogaritja e rezultateve

1. Mesatarja e leximeve të dyfishta për çdo standard, kontroll dhe kampion dhe zbrit dendësinë optike mesatare zero standarde.Ndërtoni një kurbë standarde me absorbim në boshtin vertikal (Y) dhe përqendrim të dsARN në boshtin horizontal (X）).

2. Rekomandohet kryerja e llogaritjes me softuer të përshtatjes së kurbës të bazuar në kompjuter, si p.sh. curve expert 1.3 ose ELISA Calc në një model të përshtatjes jolineare me 5 ose 4 parametra.

Performanca

1. Ndjeshmëria:

kufiri i poshtëm i zbulimit: ≤ 0,001 pg/μL (për UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (për 5-OMe-UTP-dsRNA).

kufiri i poshtëm i sasisë: 0,0156 pg/μL (për UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (për N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (për 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Saktësia: CV e Intra-Assay ≤10%, CV e Inter-Assay ≤10%

3. Rimëkëmbja:80%~120%

4.Lineariteti:0.0156-0.5pg/μL(përUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(për N1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(për 5-OMe-UTP-dsARN).

Konsideratat

1. Temperatura dhe koha e reagimit TMB janë kritike, ju lutemi kontrolloni ato në mënyrë rigoroze sipas udhëzimeve.

2. Për të arritur riprodhueshmëri dhe ndjeshmëri të mirë të analizës, është thelbësor larja e duhur e pllakave për të hequr reagentët e tepërt që nuk kanë reaguar.

3. Të gjithë reagentët duhet të përzihen tërësisht përpara përdorimit dhe të shmangen gërvishtjet gjatë shtimit të mostrës ose reagentëve.

4. Nëse kristalet janë formuar në tamponin e koncentruar të larjes (20x), ngroheni në 37℃ dhe përzieni butësisht derisa kristalet të treten plotësisht.

5. Shmangni analizën e mostrave që përmbajnë azid natriumi (NaN3), pasi ai mund të shkatërrojë aktivitetin e HRP duke rezultuar në nënvlerësimin e sasisë së dsRNA.

6. Shmangni kontaminimin me RNase gjatë analizës.

7. Standardi/kampioni, antitrupi zbulues dhe SA-HRP gjithashtu mund të kryhen në RT pa lëkundje, por kjo mund të shkaktojë një ulje të ndjeshmërisë së zbulimit me një herë.Për këtë rast, ne rekomandojmë që standardet UTP dhe pUTP dsRNA të hollohen nga 2 pg/μL, standardet N1-Me-pUTP dsRNA duhet të hollohen nga 4 pg/μL dhe standardi 5-OMe-UTP dsRNA duhet të jetë i holluar nga 8 pg/μL.Përveç kësaj, inkuboni tretësirën e punës HRP-streptavidin për 60 minuta në temperaturën e dhomës.Mos përdorni shkundësin e balonës, sepse tundësi i balonës mund të rezultojë në rezultat të pasaktë.

Rezultat tipik

1. Të dhënat standarde të kurbës

2. Llogaritja standarde e kurbës

3. Gama e zbulimit të linerit:0.0312- 1pg/μL